Влияние слизи кожи рыб на показатели гемостаза некоторых видов животных in vitro в сравнении с коллагеном

Система гемостаза представляет значительный интерес для ветеринарной медицины, так как призвана обеспечить целостность внутренней среды организма и остановку кровотечения в случае повреждения сосудистой стенки, ее проницаемость и резистентность, а также поддержание жидкого состояния крови в сосудистом русле. Различают два основных механизма остановки кровотечения при повреждении сосудов, которые в зависимости от условий могут функционировать одновременно, с преобладанием одного из механизмов ‒ это сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз [1, 2, 3].

У разных видов животных активация данных механизмов происходит неодинаково и зависит от количества и активности тромбоцитов, прокоагулянтов, антикоагулянтов, фибринолитических и множества других факторов [4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]. Возможно, с этим аспектом связана различная эффективность гемостатических препаратов, применяемых в ветеринарной хирургической практике, где для остановки кровотечений чаще всего применяются препараты на основе биологических тканей [11, 12, 13].

В 1958 году советские ученые Б. А. Кудряшов, Г. В. Андреенко, П. Д. Улитина нашли, что слизь с кожи трески, даже разведенная в 10 раз, способна свертывать оксалатную плазму в течение 12‒13 сек, и предположили, что она является богатым источником протромбокиназы [14].

Анализируя результаты наших предыдущих исследований гемостатической активности слизи кожи карпов (Cyprinus carpio carpio Linnaeus,1758), мы установили, что цельная кровь овец под ее воздействием сворачивается быстрее, а также получили достоверно более высокий индекс и скорость агрегации при использовании слизи кожи карпов как агониста тромбоцитов овец, чем при использовании АДФ, сильнейшего индуктора агрегации тромбоцитов млекопитающих. Одновременно с этим образующиеся агрегаты обладали той же устойчивостью, что и образующиеся под действием АДФ, что указывало на оптимальную структуру сгустка [15, 16, 17].

Оценке гемостатической активности слизи кожи рыб у других видов животных (травоядных и хищных) в сравнении с коллагеном (агонистом тромбоцитов) и влиянию на нее различных факторов (температуры, разведения) посвящен данный этап работы.

Цель работы: оценить влияние слизи кожи рыб на показатели гемостаза некоторых видов животных in vitro в сравнении с коллагеном.

Материалы и методы исследования. Для исследования использовали слизь с кожи 12 экземпляров карпов (Cyprinus carpio carpio Linnaeus, 1758) и 9 экземпляров африканских клариевых сомов ((Clarias gariepinus Burchell, 1822). Рыбы содержались в аквариумах и УЗВ, расположенных в АкваБиоЦентре ФГБОУ ВО Вологодская ГМХА. Слизь получали по методике Шультца и др. (Schultz et al., 2007), где слизь собиралась в полиэстеровые губки, нарезанные на кусочки 2х2х1 см. Влияние слизи на цельную кровь млекопитающих определяли следующим способом: на одно предметное стекло наносили автоматическим дозатором каплю нативной крови животных (коровы, собаки) в объеме 100 мкл, на второе предметное стекло – 50 мкл крови и 50 мкл слизи кожи рыб в свежем виде, после заморозки при температуре -20°С и разведенную фосфатно-солевым буфером, рН = 7.4 в соотношении 1:1. Каждые 30 сек определяли, при осторожном наклоне стекла, образование плотного сгустка. Точность метода оценивалась на основании результатов повторных определений гемостатической активности слизи с одной и той же порцией крови донора [19, 20].

Для оценки агрегационной активности слизи кожи рыб кровь собаки и коровы забирали из яремной вены в пробирки с цитратом натрия 3,8 % в соотношении 9:1, центрифугировали 10 мин при 1500 об./мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). Часть плазмы отбирали, а оставшуюся центрифугировали при 3000 об./мин в течение 20-ти мин, получая бедную тромбоцитами плазму. Для оценки агонистической способности слизи кожи рыб применяли количественный метод, основанный на регистрации изменений светопропускания богатой тромбоцитами плазмы с применением ФЭК по Howard M.A.

Определяли суммирующий индекс агрегации тромбоцитов (СИАТ), скорость агрегации (СА) и индекс дезагрегации тромбоцитов (ИДТ) коровы и собаки со све-жеполученной слизью кожи рыб в сравнении с коллагеном – сильнейшим активатором агрегации тромбоцитов млекопитающих. Точность метода оценивалась на основании результатов повторных определений агрегационной активности слизи с одной и той же порцией плазмы донора (не менее 9-ти определений) [15, 18, 19, 20].

Результаты обрабатывали с помощью программного пакета Microsoft Excel. Сравнение данных проводилось с применением U-критерия Манна-Уитни для независимых групп.

Результаты исследования. Качественный анализ слизи кожи рыб разных видов (севрюги (Acipenser stellatus Pallas, 1771), белуги (Huso huso Linnaeus, 1758), карпа (Cyprinus carpio carpio Linnaeus, 1758), выращенных в промышленных условиях в рыбоводческом хозяйстве ООО РТФ «Диана» Кадуйского района Вологодской области и африканского клариевого сома (Clarias gariepinus Burchell, 1822), выращенного в ООО «Аквакультура», Череповецкого района, Вологодской области) дот-блот иммуноанализом показал наличие в ней таких белков как протромбопластин и тромбопластин – инициаторов свертывания крови, а электрофорез подтвердил наличие в слизи белков с массой, соответствующей этим белкам. Иммуноблоттинг образцов слизи кожи рыб показал, что большая концентрация тромбопластина (TF) содержится в слизи севрюги, а протромбопластина (F11) больше в слизи африканского клариевого сома, что делает данные виды рыб более предпочтительными продуцентами слизи как возможной основы гемостатического препарата [21].

Слизь кожи африканского клариевого сома (Clarias gariepinus Burchell, 1822) оказалась более активна и в своем гемостатическом действии на цельную кровь коровы и собаки, чем слизь кожи карпа (табл. 1) .

Анализируя данные таблицы, можно отметить присутствие гемостатической активности слизи кожи рыб разных видов, сопоставимой с коллагеном – сильнейшим активатором агрегации тромбоцитов млекопитающих. Наиболее активна в гемостатическом отношении оказалась слизь африканского клариевого сома (Clarias gariepinus Burchell, 1822). Кровь коров и собак сворачивалась при воздействии слизи кожи сомов – на 62 и 76% быстрее нативной соответственно (рис. 1) .

Можно отметить, что заморозка слизи и разведение буферным раствором не повлияли на ее гемостатическую способность, а в некоторых случаях (слизь кожи карпов после заморозки и слизь кожи сомов свежая +1×PBS (фосфатно-солевой буфер, рН = 7.4)) свертывающая способность ее под влиянием этих факторов усилилась.

Таблица 1 ‒ Скорость свертывания цельной крови коров и собак под воздействием слизи кожи рыб разных видов

		Время образования сгустка, мин
	Количество повторов	Кровь коровы	Кровь собаки
Нативная кровь	12	16,6±1,64	5,39±1,42/*
Нативная кровь + коллаген	12	10,4±0,96	2±0,11*
Нативная кровь+слизь кожи карпов свежая	12	16,28±1,42	6,58±0,36/*
Нативная кровь+слизь кожи карпов после заморозки	12	12,4±1,4	2,4±0,23*
Нативная кровь+слизь кожи карпов свежая +1×PBS (фосфатно-солевой буфер, рН = 7.4)	12	16,2±1,25	2,3±0,17*
Нативная кровь+слизь кожи сомов	9	6,32±0,41*/*	1,28±0,14*/*
Нативная кровь+слизь кожи сомов после заморозки	9	6,2±0,41*/*	4,47±0,51/*
Нативная кровь+слизь кожи сомов свежая +1×PBS (фосфатно-солевой буфер, рН = 7.4)	9	6,56±0,56*/*	1,27±0,23*/*
* Различия с нативной кровью достоверны, (р<0,05) /* Различия с коллагеном достоверны, (р<0,05)

Рисунок 1. Относительное время свертывания цельной крови коровы и собаки при воздействии слизи кожи сомов и карпов

(1 ‒ Нативная кровь + коллаген; 2 ‒ Нативная кровь+слизь кожи карпов свежая; 3 ‒ Нативная кровь+слизь кожи карпов после заморозки; 4 ‒ Нативная кровь+слизь кожи карпов свежая +1×PBS (фосфатно-солевой буфер, рН = 7.4); 5 ‒ Нативная кровь+слизь кожи сомов; 6 ‒ Нативная кровь+слизь кожи сомов после заморозки; 7 ‒ Нативная кровь+слизь кожи сомов свежая +1×PBS (фосфатно-солевой буфер, рН = 7.4))

При изучении действия слизи на агрегационную активность тромбоцитов коровы и собаки, были получены результаты, представленные в таблице 2 .

Таблица 2 ‒ Показатели агрегации тромбоцитов животных под влиянием слизи кожи рыб разных видов

Показатели		Кровь коровы			Кровь собаки
		Слизь кожи карпов (n=12)	Слизь кожи сомов (n=9)	Коллаген (n=9)	Слизь кожи карпов (n=12)	Слизь кожи сомов (n=9)	Коллаген (n=9)
СИАТ	%	5,47±0,42	6,04±0,60	6,67±0,07	0,64±0,11*	12,77±0,23*	4,30±0,07
СА	мин	0,001±0,0003*	0,018±0,003	0,019±0,001	0,116±0,0003*	0,024±0,002*	0,008±0,001
ИДТ	%	2,82±0,42*	1,53±0,22*	6,21±0,32	0,22±0,42	0,61±0,22*	0,29±0,32

* Различия с коллагеном достоверны, (р<0,05)

Из полученных данных следует, что на агрегацию тромбоцитов коровы слизь кожи рыб действовала с той же активностью, что и коллаген – СИАТ не имел достоверных отличий, но скорость агрегации была выше при воздействии слизи кожи карпов. Тромбоциты собаки свежеполученная слизь кожи сомов активировала намного сильнее, чем коллаген и слизь кожи карпов СИАТ ‒ на 66,3 и 95% выше соответственно, что согласуется с данными, полученными при определении скорости свертывания цельной крови собаки под воздействием слизи кожи рыб разных видов.

Оптимальную структуру тромбоцитарного сгустка характеризует индекс дезагрегации тромбоцитов, который был значительно ниже для крови коровы при использовании в качестве агонистов слизи кожи рыб, чем коллагена, что указывает на большую устойчивость образующихся агрегатов (рис. 2) .

Образующиеся под воздействием слизи кожи сомов агрегаты тромбоцитов собаки были менее устойчивы, чем при использовании коллагена и слизи кожи карпов, но, в тоже время, намного более устойчивы, чем тромбоцитарные сгустки, образующиеся у коровы.

Заключение. Отличия плазменно-коагуляционного гемостаза рыб от млекопитающих могут объясняться тем, что физиологическую роль вторичного гемостаза у рыб может брать на себя выделяемая ими кожная слизь, в которой содержится очень большое количество фактора свертывания тканевого тромбопластина, тем самым выполняя роль гемостатика [14, 22].

Анализируя результаты исследования гемостатической активности слизи кожи рыб, мы установили, что как цельная кровь млекопитающих, так и богатая тромбоцитами плазма под ее воздействием сворачиваются быстрее, чем нативная, и результаты оказались сопоставимы с коллагеном – сильнейшим активатором агрегации тромбоцитов млекопитающих. Наиболее активна в гемостатическом отно- шении оказалась слизь африканского клариевого сома (Clarias gariepinus Burchell, 1822), что можно объяснить отсутствием у данного вида рыб такого фактора защиты, как чешуя.

Рисунок 2. Индекс дезагрегации тромбоцитов коровы и собаки при воздействии слизи кожи рыб и коллагена

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Вологодской области в рамках научного проекта № 18-44-350002.