Влияние способов получения резистентного крахмала на жизнедеятельность лактобактерий

Лактобактерии относятся к основным представителям микрофлоры кишечника человека и обладают способностью регулировать его микробную экологию [1]. Питательными веществами для лактобактерий в толстом кишечнике являются неперевариваемые углеводы – некрахмалистые полисахариды или, как их называют, пребиотики.

Одним из распространенных пищевых источников неперевариваемых углеводов является резистентный крахмал, который столь же важен, как и некрахмалистые полисахариды, для укрепления здоровья толстой кишки, профилактики воспалительных заболеваний кишечника и колоректального рака [2]. При этом резистентный крахмал оказывает меньшее влияние на метаболизм липидов и глюкозы, обладая низким гликемическим индексом. Это способствует поддержанию стабильного уровня сахара в крови и может помочь предотвратить развитие диабета и улучшить контроль над ним у тех, кто уже страдает этим заболеванием. Кроме того, потребление резистентного крахмала способствует снижению уровня холестерина в крови, что помогает предотвратить развитие сердечнососудистых заболеваний [3].

Резистентный крахмал – это форма крахмала, которая не гидролизуется до D-глюкозы в тонком кишечнике в течение 120 минут после употребления, а ферментируется в толстой кишке. Крахмал состоит из 2 основных структурных компонентов: амилозы, которая, по существу, представляет собой линейный полимер, в котором остатки глюкозы связаны с -D-(1–4), что обычно составляет от 15 до 20% крахмала, и амилопектина, который представляет собой более крупную разветвленную молекулу с -D-(1–4) и -D-(1–6) связями и является основным компонентом крахмала [4]. Многие исследования показали, что резистентный крахмал представляет собой линейную молекулу a -1,4–D-глюкана, полученную из ретроградизированной фракции амилозы, и имеет относительно низкую молекулярную массу (1,2 × 105 Да) [5].

Существует несколько типов резистентного крахмала [6]:

• •    Тип 1 (RS1): физически защищенный крахмал, например крахмал в зерновых оболочках или внутри клеточных структур.

• •    Тип 2 (RS2): крахмал, обладающий особыми кристаллическими структурами, которые затрудняют доступ пищеварительных ферментов к глюкозным молекулам, например, крахмал зеленых бананов или сырого картофеля.

• •    Тип 3 (RS3): ретроградный крахмал, образованный в результате охлаждения или замораживания некоторых продуктов, таких как картофель или рис. Этот тип резистентного крахмала образуется в результате реорганизации амилопластов под воздействием холода.

• •    Тип 4 (RS4): модифицированные формы крахмала (набухающий, этерифицированный, поперечно-связанный), полученные путем химического сшивания крахмала со сложными эфирами и эфирными группами.

• •    Тип 5 (RS5): некоторые исследователи выделяют также пятый тип резистентного крахмала [7]. Он представляет собой крахмаллипидные комплексы (амилоид-стеариновая кислота), нерастворимые в воде и обладающие свойствами термостабильности, что затрудняет их соединение с амилазой.

Поскольку резистентный крахмал содержится в различных природных источниках, он может быть легко включен в сбалансированную диету. Суточное потребление резистентного крахмала должно составлять 20 г, но количество поступаемого крахмала с пищей обычно недостаточно, поэтому необходимо дополнительно включать его в рацион питания [8].

В большом количестве резистентный крахмал содержится в следующих продуктах: бобовые (бобы, горох и чечевица); овес; зеленые бананы; сваренный и охлажденный картофель; кукурузная мука Hi-Maize (до 50% этой муки составляет волокно, большая часть которого – резистентный крахмал). При варке и последующем охлаждении крахмал, содержащийся в таких продуктах как картофель, рис и макароны, подвергается ретроградации, что приводит к более высокому содержанию резистентного крахмала. Поэтому количество резистентного крахмала в картофеле, рисе и других продуктах зависит также от способов приготовления и обработки [9].

Таким образом, получить резистентный крахмал 1–2 типа возможно напрямую из растительных источников. Такие продукты как цельные зерна и бобовые, содержат крахмал внутри клеточных структур. Механическая обработка, такая как дробление или измельчение, может способствовать его освобождению. Резистентный крахмал 3 типа получают физическими методами. Эти методы включают изменение структуры крахмала путем механической или термической обработки без использования химических веществ. В пищевой промышленности используются такие приемы, как тепловое увлажнение, многократное замораживание-оттаивание, автоклавирование и нагрев в микроволновой печи [10].

Резистентный крахмал 4 типа в природе не встречается, но его можно получить с помощью ферментативной и химической модификации. Процесс модификации крахмала включает различные технологические методы, направленные на изменение его структуры. В этих модификациях вводятся объемные функциональные группы, например, гидроксипропильные, ацетильные и октенильные группы янтарного ангидрида, или связи между цепями амилозы, например, через фосфатные фрагменты. Химические модификации препятствуют перевариванию крахмала, закрывая доступ ферментам и образованию атипичных связей [11].

Проведено достаточное количество исследований о влиянии резистентного крахмала на лактобактерии кишечника и микробиом в целом. Активность роста и метаболизма молочнокислых бактерий, состоящих из множества штаммов родов Lactobacillus и Bifidobacterium, обычно используется в качестве одного из маркеров для оценки пребиотиков, поскольку они отвечают за ферментацию углеводов [12]. Учеными было выявлено, что пищевые источники резистентного крахмала 2 типа могут эффективно снижать рН просвета толстого кишечника у свиней, что может быть полезно для подавления роста условно-патогенных микроорганизмов. Более того, полученные данные подтвердили, что бактерии, продуцирующие молочную кислоту, такие как лактобациллы и бифидобактерии, могут стимулироваться повышением уровня резистентного крахмала в рационе [13, 14]. К аналогичным результатам пришли другие исследователи, проводившие эксперименты с крысами [15] и цыплятами-бройлерами [16]. Резистентный крахмал не только функционирует подобно нерастворимым пищевым волокнам с точки зрения увеличения объема содержимого слепой кишки, но также служит водорастворимым пищевым волокном и, следовательно, ферментационным субстратом для кишечных бактерий [17].

Цель рабоыт – исследовать влияние способов получения резистентного крахмала на жизнедеятельность лактобактерий.

Материалы и методы

Объектами исследования являются: картофельный крахмал (ГОСТ Р 53876–2010), ООО «ПЕЦ-ХААС», г. Москва, Россия; жидкий азот, компания «Газ-трейд», г. Санкт-Петербург, Россия; ферментные препараты Дистицим БА-Т и Дистицим АГ фирмы «Erbslöh Geisenheim», Германия.

Таблица 1.

Характеристика ферментных препаратов

Table 1.

Characteristics of enzyme preparation

Ферментный препарат ( продуцент ферментов ) Enzyme preparation (enzyme producer)	Основной фермент Main enzyme	Активность, ед./мл Activity, units/mL	Действие Action	t, °C	рН
Дистицим БА-Т ( Bacillus Iicheniformis)	альфа-амилаза alpha-amylase	1600	разжижение liquefaction	30–110	5,5–8,0
Дистицим АГ, ( Asergillus niger)	глюкоамилаза glucoamylase	6500	осахаривание saccharification	30–70	4,0–6,2

Режим получения крахмальной суспензии и ферментативной обработки резистентного крахмала.

Для получения крахмальной суспензии картофельный крахмал смешивали с водой в соотношении 1:3 (гидромодуль) и добавляли ферментный препарат Дистицим БА-Т (доза внесения – 1,5 ед. АС на 1 г крахмала). Суспензию нагревали до температуры 50 °С и выдерживали при этой температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем суспензию нагревали, увеличивая температуру до 80 °C, и оставляли на выдержку при этой температуре в течение двух часов. Затем суспензию охлаждали до 60 °C, вносили ферментный препарат Дистицим АГ (доза внесения – 0,7 ед. АС на 1 г крахмала) и выдерживали при этой температуре в течение 30 мин. Затем нагрев увеличивали до 90 °C и выдерживали 1 мин.

Приготовление крахмальной суспензии и ее ферментативную обработку проводили на водяной бане LabTex, Россия. Низкотемпературную обработку крахмальной суспензии проводили в морозильной камере при температуре -18 °C и в среде жидкого азота при -196 °C. После замораживания крахмальные суспензии хранили при температуре -18 °C в течение 14 дней.

Обработку крахмальной суспензии при высоких температурах проводили в автоклаве Tuttnauer 2840ЕL-D (Израиль) при температуре 120 °C в течение 15, 30, 45, 60 мин.

Для оценки свойств модифицированного крахмала под действием высоких и низких температур крахмальные суспензии повторно обрабатывали ферментными препаратами амилолитического действия. Использовали Дистицим БА-Т (доза внесения – 1,5 ед. АС на 1 г крахмала)

и Дистицим АГ (доза внесения – 0,7 ед. АС на 1 г крахмала) и определяли количество реду- цирующих сахаров.

Определение стойкость резистентного крахмала к низким и высоким рН проводили в среде «искусственный желудок» и «искус-ствен-ный кишечник». Основу «искусственный желудок» готовили путем смешивания 0,02 г. NaCl, 0,07 мл 37%-ной НСl, 9 см3 бидистиллирован-ной воды и 5 мл приготовленной патоки. Конечные значения рН доводили до 1,2 ± 0,1. Перед использованием добавляли пепсин (0,032 г.) и доводили объем основы до 1000 мл бидистил-лированной водой. Потом инкубировали на водяной бане при 37 °C при постоянном встряхивании перемешивании со скоростью 120 об/мин в течение 90 мин.

Основу «искусственный кишечник» готовили путем смешивания 6,8 г КН 2 РО 4 , которые растворяли в 650 дм³ бидистиллированной воды с 190 см³ 0,2 н NаОН. Конечные значения рН модельного кишечного сока доводили до 7,2 ± 0,1. Образцы инкубировали на водяной бане при постоянном встряхивании в течение 120 мин. Перед использованием добавляли пепсин (3,2 г) и доводили объем основы до 1000 мл бидистил-лированной водой.

Массовую долю редуцирующих веществ определяли по ГОСТ 33917–2016. Патока крахмальная. Общие технические условия [18] методом Лейна-Эйнона (для всех видов патоки). Сущ- ность метода заключается в сравнении восстанавливающей способности раствора патоки с восстанавливающей способностью глюкозы по смеси растворов Фелинга в присутствии индикатора метиленового синего.

Массовую долю редуцирующих веществ (m рв , %) в пересчете на сухое вещество патоки вычисляли по формуле:

(p ■ m -100

m _----------- ■ 100

pR m -tn ■ V

11 ce

где φ – фактор растворов Фелинга, см³; m гл – масса навески кристаллической глюкозы, г; 100 – коэффициент пересчета массовой доли редуцирующих веществ на 100 г сухого вещества патоки, см³; m н – масса навески патоки, взятой для анализа, г; m св – массовая доля сухого вещества патоки,%; V – объем раствора анализируемой патоки, затраченный на титрование, см³; 100 – коэффициент пересчета на сухое вещество патоки,%.

Метод определения КОЕ. Непосредственный подсчет клеток на микроскопе проводился по методу Виноградского-Брида [19]. Преимущество этого метода, заключается в возможности подсчитывать клетки микроорганизмов малых размеров, так как подсчет проводят с использованием иммерсионного объектива.

Препарат готовили следующим образом: хорошо обезжиренное предметное стекло помещали на миллиметровую бумагу, на которой отмечали квадрат площадью 4 см2 и обводили его стеклографом или тушью. Брали 1 см3 среды и вносили в пробирку с 9 см3 физиологического раствора (n = 10). Затем на предметное стекло наносили из пробирки объем 0,02 см3. Тщательно распределяли суспензию бактериологической петлей по всей площади квадрата, отмеченного на стекле. Препарат подсушивали на воздухе, фиксировали в пламени спиртовки, окрашивали в течение 2 мин метиленовым синим, промывали водой и осушали фильтровальной бумагой.

На препарат наносили каплю кедрового масла и рассматривали в микроскопе с иммерсионным объективом. Чтобы результат был достоверным, подсчет числа клеток проводили не менее чем в 20 полях зрения. Общее количество подсчитанных клеток должно быть не менее 600.

В мазке микроорганизмы распределяются неравномерно: в центре их содержится больше, чем по краям. Поэтому для получения среднего значения вели подсчет по диаметру мазка, смещая поле зрения от одного конца диаметра к другому.

Количество клеток в 1 см3  суспензии вычисляли по формуле 2:

aSn sV

где C – число клеток в 1 см3 суспензии; a – среднее число клеток в одном поле зрения; S – площадь приготовленного мазка (400 мм2); n – разведение исходной суспензии; s – площадь поля зрения (0,02 мм2); V – объем нанесенной на предметное стекло суспензии микроорганизмов (0,01 или 0,02 см3).

Результаты

На первом этапе проведения экспериментов была получена крахмальная суспензия. В дальнейшем крахмальная суспензия была разделена на несколько образов, которые подвергались различным температурным воздействиям: замораживанию при -18 °С, -196 °С, автоклавированию при 120 °С в течение 15, 30, 45 и 60 мин.

Степень резистентности крахмала, полученного после термической обработки (замораживания и автоклавирования), оценивали по количеству редуцирующих веществ. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Содержание редуцирующих сахаров в образцах крахмальной суспензии после термической обработки

Table 2.

The content of reducing sugars in samples of starch suspension after thermal treatment

Режим низкотемпературной обработки крахмальной суспензии Mode of low-temperature processing of starch suspension	Содержание редуцирующих сахаров (%) Reducing sugars content (%)
	После первой обработки ферментными препаратами After the first enzymatic treatment	После второй ферментативной обработки After the second enzymatic treatment	В среде «искусственный желудок» In “artificial stomach” medium	В среде «искусственный кишечник» In “artificial intestine” medium
Контроль | Control	24,13	38,00	32,40	34,17
-18 °C	20,34	29,90	24,00	25,70
-196 °C	22,00	31,00	27,30	29,00
120 °C, 15 мин	20,13	27,65	23,24	24,02
120 °C, 30 мин	19,24	29,67	23,40	24,70
120 °C, 45 мин	19,30	29,93	24,39	26,60
120 °C, 60 мин	19,77	30,25	26,72	27,50

Далее была проведена серия экспериментов, в которых был показан рост лактобактерий в зависимости от типа резистентного крахмала, включенного в питательную среду лактобактерий.

Таблица 3. Количество клеток лактобактерий, выращенных в среде с добавлением крахмальной суспензии, полученной разными видами термической обработки

Table 3.

The number of lactobacilli cells grown in a medium supplemented with starch suspension obtained through various types of thermal treatment

Режим обработки пит. среды Medium treatment mode	Количество клеток в 1 см3 (×108) Number of cells in 1 cm3 (×108)
Контроль | Control	6,26
-18 °C	11,60
-196 °C	8,36
120 °С, 15 мин	12,20

Обсуждение

Исходя из результатов, представленных в таблице 2 следует, что низко- и высокотемпературные воздействия влияют на содержание редуцирующих веществ. После обработки крахмальной суспензии температурой -18 °C, содержание редуцирующих веществ снизилось на 13,7%; после -196 °C – на 8,8%; после автоклавирования при 120 °C в течение 15 мин – на 16,6%; после автоклавирования при 120 °C в течение 30 мин – на 20,3%; после автоклавирования при 120 °C в течение 45 мин – на 20%; после автоклавирования при 120 °C в течение 60 мин – на 18,1%. Менее всего количество редуцирующих веществ снижается в процессе замораживания крахмальной суспензии при – 196 °C и более всего в процессе автоклавирования при 120 °C в течение 30 мин.

Для оценки степени резистентности полученного крахмала проводили ферментативную обработку крахмальной суспензии. Для этого во все образцы вносили ферменты альфа-амилазу иглюкоамилазу, после чего определяли количество полученных редуцирующих веществ в крахмальных суспензиях.

В результате было получено, что в контрольном образце (который не подвергался низко-и высокотемпературным воздействия) количество редуцирующих веществ увеличилось на 34,27%, После обработки крахмальной суспензии температурой -18 °C содержание редуцирующих веществ увеличилось на 18%; после -196 °C – на 24%; после автоклавирования при 120 °C в течение 15 мин – на 15%; после автоклавирования при 120 °C в течение 30 мин – на 22%; после автоклавирования при 120 °C в течение 45 мин – на 26,4%; после автоклавирования при 120 °C в течение 60 мин – на 35,15%.

Самый низкий процент увеличения редуцирующих веществ – 15% был зафиксирован в образце после обработки крахмальной суспензии при автоклавировании при 120 °C в течение 15 мин.

Влияние высокого рН на устойчивость крахмала проводили проводили в среде «искусственный кишечник». В результате было отмечено повышение содержания редуцирующих веществ в контрольном образце (который не подвергался низко и высокотемпературным воздействия) количество редуцирующих веществ увеличилось на 41,6%, После обработки крахмальной суспензии температурой -18 °C содержание редуцирующих веществ увеличилось на 26,4%; после -196 °C – на 31,8%; после автоклавирования при 120 °C в течение 15 мин – на 19,3%; после автоклавирования при 120 °C в течение 30 мин – на 28,3%; после автоклавирования при 120 °C в течение 45 мин – на 37,8%; после автоклавирования при 120 °C в течение 60 мин – на 39,1%.

Анализируя полученные результаты следует отметить, что наименьший гидролиз крахмала при рН 7,8 был отмечен в образце после автоклавирования при 120 °C в течение 15 мин – на 19,3%. Данный эксперимент можно считать успешным, так как резистентный крахмал должен быть устойчивым к высоким рН, гидролиз крахмала протекать не будет. А результаты, представленные в таблице 3, показывают, что наибольший рост микроорганизмов отмечен на питательной среде с крахмальной суспензией после автоклавирования при 120 °С в течение 15 мин. Таким образом, в полученной крахмальной суспензии резистентный крахмал сможет быть питательной средой для микроорганизмов, в частности лактобактерий, населяющих толстый кишечник организма человека.

Заключение

В ходе исследования был проведен анализ различных методов получения резистентного крахмала, а также оценена степень устойчивости полученного резистентного крахмала в крахмальной суспензии по количеству образующихся редуцирующих веществ при использовании различных методов, включая воздействие фер- ментными препаратами амилолитического действия и изменение рН окружающей среды. Кроме того, был изучен рост количества лактобактерий на питательных средах с добавлением полученных суспензий.

Полученные результаты показали, что варьирование режимов низко- и высокотемпературной обработки позволяет получать крахмал с различной степенью устойчивости и разным количеством образующихся редуцирующих веществ. Этот вывод имеет важное значение в контексте включения резистентного крахмала в рецептуры функциональных пищевых продуктов. Особенно это актуально для приготовления ферментированных продуктов на основе зерна или сока, где редуцирующие вещества играют важную роль на стадиях приготовления. Кроме того, резистентный крахмал может быть использован в качестве пребиотика, обеспечивая питательную среду для микрофлоры кишечника. Таким образом, результаты исследования могут быть применены для разработки новых и улучшения существующих функциональных продуктов питания с учетом их пищевой ценности и влияния на микробиоту кишечника.