Влияние температуры культивирования на динамику роста Lactobacillus sakei в питательных средах с различным белковым субстратом

На протяжении последних десятилетий большое внимание науки и пищевых технологий уделяется поиску и изучению природных антимикробных агентов, которые безопасно и эффективно защищают пищевые продукты от развития технически вредных и патогенных микроорганизмов: Listeria monocytogenes , Clostridium botulinum , Staphylococcus aureus и других [1–4].

Известно, что некоторые виды молочнокислых бактерий, например родов Lactobacillus, Lactococcus и Pediococcus, способны продуцировать антибиотико-подобные пепти- ды – бактериоцины, обладающие антимикробными свойствами. Наиболее изученными бактериоцинами с доказанной безопасностью являются низин, продуцируемый Lactococcus lactis, и педиоцин, продуцируемый Lactobacillus plantarum или Pediococcus acidilactici. Их применение в качестве пищевых консервантов имеет одобрение в более чем 40 странах, включая ЕС и США [5–9]. Сообщается, что низин и педиоцин обладают антибактериальной активностью в отношении широкой группы грамположительных бактерий, включая Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Listeria monocytogenes, и малоэффективны против плесеней, дрожжей и грамотрицательных бактерий [10–12].

Методы выделения и исследование антимикробных свойств новых, малоизученных бактериоцинов представляет важную задачу и является актуальным. Так, в последние годы внимание биотехнологов обращено к сакацину – бактериоцину, синтезируемому бактериями Lactobacillus sakei . Исследования сообщают о его высокой антимикробной активности в отношении Enterococcus faecalis и Pseudomonas aeruginosa . Однако способы получения сака-цина и условия культивирования его продуцентов изучены недостаточно [13–15].

Культивирование микроорганизмов может осуществляться как на твердых, так и в жидких питательных средах, однако для молочнокислых бактерий, включая Lactobacillus sakei , в литературе отмечается преимущество суспензионного (глубинного) метода. Твердые среды, например, агаризованные, традиционно применяются для выделения чистых культур и первичного скрининга, но их использование ограничено в промышленных масштабах из-за сложности контроля параметров и низкой воспроизводимости. В отличие от них, жидкие среды обеспечивают равномерное распределение питательных веществ, газообмен и возможность точной регуляции критически важных параметров, таких как pH, температура и аэрация, что особенно важно для молочнокислых бактерий, активно продуцирующих органические кислоты и бак-териоцины [16–20].

Как отмечают Todorov и др. [21], глубинный метод в биореакторах позволяет не только стабилизировать условия роста, но и поддерживать оптимальный pH за счет автоматического титрования, предотвращая подавление роста клеток накоплением метаболитов. Это критично для получения высокой биомассы и целевых бактериоцинов, которые синтезируются в определенных фазах роста. Кроме того, жидкие среды обеспечивают эффективное масштабирование – от лабораторных ферментеров до промышленных биореакторов объемом до 1000 л, что делает метод экономически выгодным. Несмотря на это, для Lactobacillus sakei остается дефицит данных по оптимизации состава сред и режимов культивирования, что затрудняет разработку стандартизированных протоколов для увеличения выхода антимикробных соединений [22].

Известно, что для быстрого развития молочнокислым бактериям необходимы питательные среды, включающие оптимальные источники углерода, азота, витаминов и микроэлементов, а также создание соответствующих физико-химических условий (температура, интенсивность перемешивания, аэрация, уровень pH). Для выделения ацидофильных молочнокислых бактерий в качестве селективной питательной среды традиционно используется среда MRS (Man-Rogosa-Sharpe), в которой источниками азота выступают ферментативный гидролизат казеина и дрожжевой экстракт. При культивировании бактериоцинпродуцирующих лактобактерий особое значение имеют белковые субстраты в питательных средах. Сообщается, что замена гидролизата казеина на соевый и пшеничный гидролизаты снижает скорость биосинтеза бактериоцинов у Lactobacillus sakei на 15– 20 %. Это связано с дефицитом пролина и лизина в растительных субстратах, которые критичны для метаболизма молочнокислых бактерий. Кроме того, повышение концентрации дрожжевого экстракта c 0,4 до 2,5 % в MRS-среде стимулирует продукцию педиоцина PA-1 штаммом Pediococcus acidilactici за счет увеличения доступности витаминов группы B [23, 24].

Большое влияние на протекание процесса культивирования микроорганизмов оказывает температура. Сообщается, что температурный оптимум развития штаммов Lactobacillus sakei лежит в довольно широких пределах от 26 до 37 °C, что подтверждает важность выбора температурных режимов культивирования [16, 25].

Контроль pH среды является важным аспектом разработки культивирования Lactobacillus sakei. Исследования Leroy и др. [26] демонстрируют, что поддержание pH в диапазоне 6,0–6,5 позволяет минимизировать продолжительность лаг-фазы и увеличить скорость роста культуры. Статирование обеспечило более стабильные условия культивирования, способствовавшие увеличению как числа жизнеспособных клеток, так и синтеза белка. Условия без статирования показали ограниченный рост и продукцию белка из-за накопления кислотных продуктов метаболизма и снижения pH. Ранее нами было исследовано, что добавление щелочного раствора 1н NaOH в ключевые моменты предотвращало резкое снижение pH, поддерживая его на уровне, благоприятном для роста Lactobacillus sakei (6,1–6,7).

Цель работы – изучить влияние температурного фактора на динамику роста Lactobacillus sakei при культивировании на различных белковых субстратах.

Объекты и методы исследований

В качестве объекта исследования использовали лиофилизированную культуру Lactobacillus sakei DSM-20498. Культивирование осуществляли на модифицированных питательных средах MRS (Condalab, Испания). В качестве белкового субстрата использовали сухой ферментативный мясной пептон (Condalab, Испания) и сухой экстракт куриного белка, полученный из мышечной ткани кур путем экстракции при температуре 85 °С, путем распылительной сушки при температуре на входе 120 °С до влажности (6 ± 0,5) %. Исходная концентрация вносимого белкового субстрата составляла 20 г на 1000 мл готовой питательной среды. Состав питательной среды приведен в табл. 1.

В табл. 2 приведены характеристики используемых белковых субстратов.

Питательные среды инокулировали суспензионными клетками культуры Lactobacillus sakei DSM-20498 в количестве 2,5 × 10⁷ КОЕ (колониеобразующих единиц) в каждый подготовленный образец питательной среды объемом 200 мл. Культивирование

Lactobacillus sakei осуществляли в шейкере-термостате Stegler-22B (100 линейных движе-ний/мин) при температурах (27 ± 1), (32 ± 1), (37 ± 1) и (42 ± 1) °C. Исходный уровень рН питательных сред составлял (6,5 ± 0,05). Для контроля кислотности культуральных сред в процессе культивирования измеряли рН на pH-метре Hanna HI2210 с периодичностью 1 ч. Для статирования рН среды использовали 1 н NaOH.

Концентрацию клеточной суспензии в процессе культивирования определяли путем измерения ее оптической плотности спектрофотометрическим методом (л = 590 нм) каждые 2 ч с последующим пересчетом на количество клеток в суспензии в КОЕ/мл по калибровочному графику, полученному методом посева стандартной серии культуры на плотную среду MRS (HI Media) [27].

Удельную скорость роста микроорганизмов (μ, ч–1) в экспоненциальной фазе рассчитывали по формуле [28]:

• 2,303∙ (lg N_T -lg N_o )

V = , т ^- ^0

где ^0 – начальная концентрация клеток (КОЕ/мл); N_T – концентрация клеток в момент времени T;Т- ^0 – промежуток времени роста.

Для получения достоверных результатов эксперимент проводили в 3-кратной повторности. Числовые значения, указанные на графиках, являются среднеарифметическими с

Таблица 1

Состав питательной среды МRS

Компоненты	Количество, г/кг	Компоненты	Количество, г/кг
Белковый субстрат	20,00	Натрия гидрофосфат	2,00
Глюкоза	20,00	Твин 80 (Е433)	1,00
Дрожжевой экстракт	5,00	Магний сульфат	0,10
Натрия ацетат	5,00	Марганца сульфат	0,05
Аммония цитрат	2,00	Вода дистиллированная	до 1 кг

Таблица 2

Характеристики белковых субстратов

Состав Экстракт куриного белка Мясной пептон Содержание сырого протеина, % 83,0 80,0 Влажность, % 6,0 6,0 Средняя молекулярная масса белковых веществ, кДа 80,0 5,0 достоверностью P = 0,95, доверительный интервал Δ ± 10,0 %.

Результаты и их обсуждение

На рисунке в полулогарифмической системе координат «десятичный логарифм КОЕ/мл – время» приведена динамика роста культуры Lactobacillus sakei в исследуемых температурных режимах.

В полулогарифмических координатах экспоненциальная фаза роста представляет собой прямую, тангенс угла наклона которой к временной оси численно равен величине удельной скорости роста культур ц, ч^-1 [28].

В табл. 3 приведены полученные расчетным путем значения удельной скорости роста культуры L. sakei в исследуемых температурных режимах.

Установлено, что наибольшая удельная скорость роста Lactobacillus sakei DSM-20498 при культивировании на различных белковых субстратах достигается при температуре

(32 ± 1) °C. При этом максимальное значение ц (0,63 ч^-1) и наибольший прирост биомассы культуры наблюдался на питательных средах с мясным пептоном, что, очевидно, связано с лучшей усвояемостью белковых веществ пептонового субстрата, отличающихся от экстракта куриного белка более низкой молекулярной массой. Так, стационарная фаза на пептоновых субстратах достигалась уже на 7 час культивирования, что в 1,5 раза быстрее, чем на среде с экстрактом куриного белка. Следует отметить, что по мере увеличения продолжительности культивирования разница в накоплении биомассы на исследуемых белковых субстратах нивелируется, поскольку продуцируемые в процессе роста культуры Lactobacillus sakei протеазы способствуют расщеплению белков до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот.

Одновременно отмечено, что с повышением температуры культивирования выше 37 °C

а)

б)

Динамика роста L. sakei в полулогарифмических координатах в различных температурных режимах: а) питательная среда с добавлением мясного пептона;

б) питательная среда с экстрактом куриного белка

Таблица 3

Удельная скорость роста Lactobacillus sakei DSM-20498 , д, ч~ ¹

Белковый субстрат Температура культивирования, °C 27 32 37 42 Экстракт куриного белка 0,18 0,36 0,33 0,24 Мясной пептон 0,29 0,63 0,45 0,34 наблюдается снижение скорости роста Lactobacillus sakei, которое может быть связано с активацией теплового шока микроорганизмов, приводящего к снижению метаболической активности и скорости деления клеток. На средах с мясным пептоном разница в скорости накоплении биомассы при культивировании в условиях 32 и 37 °C меньше, чем на средах с экстрактом куриного белка, что, скорее всего, связано с большей доступностью низкомолекулярных питательных веществ в средах на мясном пептоне.

Выводы

В результате проведенных исследований установлено, что культура Lactobacillus sakei DSM-20498 демонстрирует высокую чувствительность к изменениям параметров культи- вирования, в том числе, температурному режиму и составу белкового субстрата. Отмечены активный рост биомассы и высокая плотность клеточной популяции Lactobacillus sakei при культивировании на низкомолекулярном белковом субстрате.

Использование пептона в качестве источника белка в питательных средах является предпочтительным для культивирования Lactobacillus sakei ввиду его более высокой биодоступности.

Дальнейшие исследования будут направлены на культивирования Lactobacillus sakei в выбранных условиях для получения активных белковых метаболитов, изучения их фракционного состава и барьерных свойств.