Влияние условий культивирования и противогрибковых средств на продукцию артроконидий грибами Trichophyton verrucosum

Дерматофитоз – это микотическая     артроконидии могут быть дремлющей инфекция,       которая       поражает      формой, ответственной за сохранение поверхностный ороговевший слой (кожу,      хронической рецидивирующей формы волосы) человека [1] и животных [9]. Грибы      инфекции. Несмотря на быстрое

Trichophyton verrucosum являются наиболее      улучшение лечения в течение последнего распространенными       возбудителями      десятилетия,      многие      аспекты дерматофитозов у крупного [5] и мелкого     дерматофитных   инфекций   остаются

• [2]    рогатого скота. Споры в поражениях      малоизученными [8]. Существует разница

кожи и инфицированных волосах при     между      восприимчивостью      к дерматофитозе считаются основной     артроконидиям и микроконидиям, и это причиной инфекции кожи у людей и     может быть одной из причин животных [10]. Инфекция, вызываемая      терапевтических неудач и различного этими паразитическими спорами, является      уровня резистентности к антибиотикам.

важной    проблемой    общественного      Coelho и соавт. [4] показали, что здравоохранения и ветеринарии, которая до      артроконидии более устойчивы к сих пор не решена.                            флуконазолу,     гризеофульвину     и

В      некоторых      условиях      итраконазолу,    чем    микроконидии.

T. verrucosum продуцирует споры путем     Возможными причинами терапевтических деления          неспециализированных      неудач является именно развитие вегетативных гифов на цилиндрические     устойчивости к противогрибковым или сферические клетки, которые      препаратам [12]. Артроконидии часто называются    артроконидиями.    По-     обнаруживаются     при     поражении видимому, они играют важную роль в      стригущим лишаем. Рост в роговом слое патогенезе заболевания. Образование      кожи и волосах происходит в виде гифов, артроконидий      характерно      для      которые затем могут образовывать дерматофитной инфекции кожи и волос      артроконидии. Duek и соавт. [6] показали,

• [14] . Артроконидии устойчивы к     что грибковые элементы проникают между

неблагоприятным условиям окружающей      слоями рогового слоя и разделяют их.

среды, поэтому одной из наиболее важных           Между тем, проведенный нами проблем, связанных с лечением      анализ литературных данных показал, что в дерматофитных инфекций, является     настоящее время мало информации о сохранение артроконидий в окружающей     продуцировании артроконидий грибами среде, что может быть причиной      T. verrucosum.

повторного заражения [11]. Возможно, что            В этой статье мы описываем изучение влияния окружающей и культуральной сред, а также некоторых противогрибковых средств, на образование артроконидий in vitro грибами T. verrucosum.

Материал и методы исследований. В общей сложности были использованы 6 изолятов дерматофитов T. verrucosum из очагов поражения кожи 6 бычков и коров частного сектора Высокогорского района республики Татарстан в 2022 году. Культуры поддерживали при 27 °C и ежемесячно пересевали на агаре Сабуро, приготовленном на дистиллированной воде.

Для получения артроконидий использовали обычный для агара Сабуро рН 5,6; другие значения рН были получены добавлением гидроксида натрия или хлористоводородной кислоты (HCL). Также использовался агар Сабуро с добавками 1, 2, 3, 4, 5 и 10 % NaCl. Для изучения влияния противогрибковых препаратов на образование артроконидий мы добавляли к агару Сабуро тербинафин, гризеофульвин и клотримазол, применяемые при терапии дерматофитии [13]. Все противогрибковые препараты растворяли в диметил сульфоксиде (ДМСО), и ДМСО в той же концентрации использовали в контроле. Культуры инкубировали в чашках Петри в течение 14 дней в различных условиях. Варьировались температура, концентрация CO2 в газовой среде, а также проводилось инкубирование в аэробных условиях. Через 14 дней роста в чашку Петри на поверхность агара наливали небольшое количество фосфатного буфера (PBS) и собирали, удаляли образовавшийся нарост, осторожно соскабливая поверхность агара стеклянной палочкой. Собранные культуры T. verrucosum ресуспендировали в PBS и промывали, осторожно перемешивая. Надосадочную жидкость отделяли и фильтровали через фильтр с размером пор 12 мкм (Millipore). Фильтрат исследовали микроскопированием при 40-кратном увеличении, количество артроконидий считали в четырех случайно выбранных полях зрения и усредняли. Артроконидии определялись как любой гиф-компартмент длиной менее 4 мкм или любая сферическая клетка диаметром менее 4 мкм, которая по форме явно отличается от микроконидий.

Результат исследований.

Результаты влияния температуры на образование артроконидий у 6 изолятов T. verrucosum , использованных в нашем исследовании, при инкубировании в 8 % концентрации CO 2 на среде агар Сабуро через 12 дней приведены на рисунке 1. Было определено, что температура заметно влияет на образование артроконидий. Для оптимального размножения артроконидий T. verrucosum температура должна составлять 36 °C, что выше, чем температура поверхности тела, обычно от 32 °C до 34 °C. Не наблюдалось роста гриба при 42 °C. Так как наибольшее образование артроконидий наблюдалось при 36 °C, эти условия были использованы в качестве стандарта при сравнении влияния различных факторов на продукцию артроконидий. Оптимальная продолжительность продуцирования артроконидий составила 12 дней (Рисунок 2). Оптимальная концентрация CO 2 8 %. В аэробных условиях образования артроконидий не происходило (Рисунок 3). Проведенное исследование показало, что повышенное содержание в газовой среде CO 2 , 8 %, которое является оптимальным, имеет важное значение для образования артроконидий in vitro у T. verrucosum . Но между тем, является ли стимуляция образования артроконидий следствием присутствия самого CO 2 или пониженного содержания кислорода было предметом некоторых споров [3]. CO 2 физиологически диффундирует из нормальной кожи. Под лечебной повязкой на поверхности кожи концентрация CO 2 достигает значений от 5 % до 8 %. Такие концентрации также обнаруживаются, когда кожа повреждена инфекцией или травмой, а как показали результаты нашего исследования, возникновение повышенного содержания CO 2 может стимулировать трансформацию гифов дерматофитов в цепи артроконидий.

Рисунок 1 - Влияние температуры на образование T. verrucosum артроконидий через 12 дней на агаре Сабуро. Показаны средние значения (n = 6)

Рисунок 2 – Влияние времени инкубации на образование T. verrucosum артроконидий на агаре Сабуро при 36°C. Показаны средние значения (n = 6)

Рисунок 3 – Влияние концентрации CO 2 на образование T. verrucosum артроконидий через 12 дней на агаре Сабуро при 36 °C. Показаны средние значения (n = 6)

Таблица 1 – Влияние содержания NaCl в среде на образование T. verrucosum артроконидий

Количество артроконидий в поле зрения
Агар Сабуро	Агар Сабуро + 1 % NaCl	Агар Сабуро + 2 % NaCl	Агар Сабуро + 3 % NaCl
70,2 ± 7,5	62,5±9,6	21,4±3,5	2,2 ± 0,5

Показаны средние значения (n = 6)

NaCl ингибировал рост T. verrucosum и как следствие снижал количество артроконидий. При 3 % NaCl роста не наблюдалось (Таблица 1).

Исследовалось влияние на образование артроконидий противогрибковых веществ в низких, не ингибирующих рост концентрациях.

Исследованы гризеофульвин, клотримазол и тербинафин в качестве добавки в агар

Сабуро при 8 % концентрации CO 2 и 36 °C (Таблица 2).

Таблица 2 – Влияние добавки противогрибковых веществ в агар Сабуро на образование T.

verrucosum артроконидий

Противогрибковое вещество	Концентрация, мкг/мл	Количество артроконидий в поле зрения
Гризеофульвин	0,25	92,4±5,9
	0,5	92,6±5,2
Клотримазол	0,25	86,8±5,8
	0,5	92,6±4,9
Тербинафин	0,25	22,8±2,8
	0,5	20,4±2,6
Контроль агар Сабуро	Нет	71,8±5,8
Контроль агар Сабуро+ДМСО	Нет	73,3±5,7

Показаны средние значения (n = 6)

Таблица 3 – Влияние pH на образование T. verrucosum артроконидий через 12 дней на агаре Сабуро при 36°C

рН	Количество артроконидий в поле зрения
4,5	6,4±0,9
5,0	7,5±0,7
5,5	14,8±1,3
6,0	21,8±2,3
6,5	63,8±6,6
7,0	68,8±6,3
7,5	70,2±7,2
8,0	60,8±6,6
8,5	34,8±3,2
9,0	30,8±2,8
9,5	25,3±2,7

Показаны средние значения (n = 6)

Наши исследования показали, что гризеофульвин (0,25-0,5 мкг/мл) и клотримазол (0,25-0,5 мкг/мл) стимулировали образование артроконидий у T. verrucosum. Интересно, что тербинафин (0,25-0,5 мкг/мл) уменьшал образование артроконидий. Между тем, все они являются эффективными и быстродействующими средствами лечения дерматофитии [15]. Полученные нами результаты являются клинически значимыми, так как показывают, что, если в некоторых областях поражения не достигается достаточная концентрация фунгицида, противогрибковое средство может стимулировать трансформацию гиф в артроконидии. Это явление может объяснить случаи неудачного лечения и рецидивов, которые происходят при использовании доступных в настоящее время терапевтических средств. Спящие артроконидии устойчивы к обычным противогрибковым препаратам, таким как клотримазол, миконазол, нистатин и гризеофульвин. Толстые стенки артроконидий могут сопротивляться их действию, для того, чтобы прорасти после прекращения лечения.

В результате проведенных нами исследований было определено, что оптимальный рН для образования артроконидий составляет 7,5 (Таблица 3).

Таким образом, вероятно рН кожи является важным фактором в образовании артроконидий [7].

Заключение. В ходе проведенного нами исследования были определены факторы, которые либо ингибировали, либо стимулировали образование артроконидий T. verrucosum , включая температуру, содержание CO 2 в газовой среде, параметры культуральной среды и противогрибковые препараты. Образование артроконидий оптимально происходило на агаре Сабуро при 8 % содержании CO 2 , 36 °C и рН 7.5 и было максимальным через 12 дней. Рост гриба при 42 °C прекращался. NaCl ингибировал рост T. verrucosum , и при 3 % NaCl роста не наблюдалось. Гризеофульвин и клотримазол индуцируют образование артроконидий, а тербинафин снижает. Полученные нами результаты являются клинически значимыми, так как показывают, что, если в некоторых областях поражения не достигается достаточная концентрация фунгицида, противогрибковое средство может стимулировать трансформацию гиф в артроконидии и сохранение инфекции.