Влияние условий культивирования на качество бактериального концентрата с холестеринметаболизирующими свойствами

В последнее время сердечно-сосудистые заболевания продолжают оставаться основной причиной смертности и инвалидности населения, вызывая наибольшее количество социальных и экономических потерь. По сравнению с развитыми странами Запада в России показатель сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности оказался в пять-шесть раз выше. На сегодняшний день установлено более 200 факторов риска, но наиболее распространенными и значимыми являются высокие цифры артериального давления и повышенный уровень холестерина. Результаты исследований, проведенных в Государственном научно-исследовательском центре профилактической медицины, показывают, что около 40% населения России в возрасте 30 лет и старше имеют те или иные факторы риска. В нашей стране от болезней, вызванных атеросклерозом, умирает более 50% людей в возрасте старше 30 лет. Материальный ущерб при этом не поддается исчислению.

Необходимо отметить, что важнейшая роль в профилактике и коррекции нарушений липидного обмена, предупреждении прогрессирования уже развившихся атеросклеротических поражений сосудов принадлежит применению системных продуктов здоровья на основе пробиотических микроорганизмов.

Анализ опубликованных в литературе данных о биологически активных соединениях, продуцируемых пробиотическими микроорганизмами, показал, что до настоящего времени биотехнологический потенциал анаэробных микроорганизмов бифидобактерий, пропионовокислых и лактобактерий практически не используется. Между тем не вызывает сомнения, что эти микроорганизмы являются новым источником промышленного получения ценных метаболитов в биопродуктах. Важность проведения исследований в области микробной экологии, изучения мутагенеза, метаболизма холестерина пробиотическими микроорганизмами определяется необходимостью создания биопродуктов массового потребления для поддержания и сохранения здоровья населения, которые составят достойную конкуренцию традиционным лекарственным средствам. Механизм лечебно-профилактического действия пробиотиков является многогранным и обусловлен не только высоким содержанием жизнеспособных клеток, но и синтезом внеклеточных метаболитов, усиливающих пробиотический эффект. Экзометаболиты пробиотических микроорганизмов подавляют рост патогенной микрофлоры, обладают радиопротекторными, противоопухолевыми, дисмутагенными, иммунокоррегирующими, холестеринметаболизирующими и др. свойствами [1, 2]. Потенциальная возможность к накоплению биологически активных веществ пробиотическими микроорганизмами различна, зависит от видовой и штаммовой принадлежности и проявляется в определенных условиях. Это свидетельствует о перспективности изучения прокариот как источников биологически активных веществ для создания продуктов нового поколения.

Целью данной работы является подбор условий культивирования пропионовокислых бактерий и лактобацилл для получения комбинированного бактериального концентрата с высокой антимутагенной и холестеринметаболизирующей активностью.

Объекты и методы исследований

Объектом исследований служили чистые культуры пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii АС 2503, полученные из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (Москва), активизированные уникальным биотехнологическим методом, разработанным в ВСГТУ, и Lactobacillus helveticus 3 5-1 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика.

Культивирование микроорганизмов проводили на разработанной нами питательной среде на основе молочной сыворотки [3], в которую добавляли 1% очищенной сыворотки крови человека. Сыворотку крови получали с МУЗ «Бурятская республиканская станция переливания крови». В качестве контроля использовали питательную среду без добавления сыворотки крови. Накопление биомассы микроорганизмов проводили путем периодического культивирования при 30оС. Рост культур оценивали по изменению оптической плотности λ = 550 нм на фотоэлектроколориметре. Титр жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий определяли по числу КОЕ при высеве клеточной суспензии на среду ГМК, а лактобацилл на среду MRS.

Для определения уровня холестерина использовали ферментативный метод [4]. Принцип метода заключается в том, что под действием фермента холестеринэстеразы эфиры холестерина распадаются на холестерин и перекись водорода. Далее холестерин под воздействием холестериноксидисмутазы дает окрашенное соединение. Интенсивность окраски в реакционной смеси прямо пропорциональна концентрации холестерина в пробе. Концентрацию холестерина в пробе определяли расчетным методом. Биосинтез экзополисахаридов (ЭПС) определяли антроновым методом [5], антимутагенную активность определяли по тесту Эймса [6], адгезивные свойства по методу Брилис [7].

Результаты и их обсуждение

При соединении штаммов разных видов бактерий важно добиться их сочетаемости, взаимного стимулирования и обеспечения активного роста заквасочных культур. На основании скрининга различных видов и штаммов пробиотических микроорганизмов нами были выбраны заквасочные культуры P. shermanii AC 2503 и L. helveticus 3 5-1 , обладающие наиболее высокой холестеринметаболизирующей активностью для создания комбинированного бактериального концентрата. Ранее нами установлено, что наиболее благоприятными условиями для совместного культивирования P. shermanii AC 2503 и L. helve-ticus 3 5-1 являются соотношение 95:5 и температура 30^оС. При этом отмечается сбалансированный рост микроорганизмов, выраженная холестеринметаболизирующая активность, умеренная кислотность, активность ферментации молока 10-12 ч и высокое количество жизнеспособных клеток [8]. Характеристика инокулята представлена в таблице 1.

Таблица 1 Качественная характеристика комбинированного инокулята

Показатель	Характеристика
Внешний вид и консистенция	Однородная, в меру плотная, без отстоя сыворотки
Вкус и запах	Чистый кисломолочный, без посторонних привкусов и запахов
Цвет	Молочно-белый или с кремовым оттенком
Продолжительность ферментации, ч	10-12
Кислотность, °Т	80 + 1

Продолжение таблицы 1

Активная кислотность, рН	4,72
Холестеринметаболизирующая активность, %	89,41 + 0,1
Количество жизнеспособных клеток P. shermanii, КОЕ в 1 см3	2*109
Количество жизнеспособных клеток L. helveticus, КОЕ в 1 см3	1*109
Контаминация	отсутствует

Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о высокой холестеринметаболизирующей активности инокулята. Исследования показали, что сочетание микроорганизмов в комбинированной закваске повышает ее холестеринметаболизирующую активность.

В дальнейших исследованиях изучали влияние условий культивирования на рост комбинированной закваски. Следует отметить, что доза вносимого инокулята должна обеспечивать начало роста микроорганизмов с минимальной лаг-фазой. Нами было установлено, что оптимальная плотность популяций и рост микроорганизмов достигаются при внесении 3 % инокулята. Результаты исследований представлены на рисунке.

Время, ч

—▲— Закваска на основе L. helveticus —♦— Комбинированная закваска

—■— Закваска на основе P. shermanii

Рис. Рост биомассы пробиотических микроорганизмов в процессе культивирования

Таблица 2

Качественная характеристика комбинированного бактериального концентрата в жидкой форме

Показатель		Характеристика
1		2

Вкус и запах Консистенция и внешний вид Цвет Предельные значения рН Температура при выпуске с предприятия, °С Количество клеток, КОЕ/см3 L. helveticus 3 5-1 P. shermanii AC 2503 Холестеринметаболизирующая активность, % Антимутагенная активность (ингибирование), % Адгезивные свойства: СПА КУЭ, % ИАМ (М + m) Биосинтез экзополисахаридов, мкг/мл Объем продукта (см3), в котором не допускаются: БГКП (колиформы) S. aureus Патогенные микроорганизмы ( в т.ч. сальмонеллы) Дрожжи, КОЕ/см3, не более Плесени, КОЕ/см3, не более

Чистый, слегка кисловатый, без посторонних привкусов и запахов Однородная, с незначительным отстоем сыворотки От белого до светло-желтого 4,6-4,8 4-6 2*1011 1*1011 93,51 + 0,1 50,4 4,8 86 5,58 + 1,1 1,08 10 10 50 10 10

Из рисунка видно, что максимальный прирост биомассы заквасочных культур достигается к 18 часам культивирования, т.е. к концу экспоненциальной фазы развития, затем следует стационарная фаза, где наблюдается остановка роста микроорганизмов. Следует отметить наиболее активный рост бактериальной массы при культивировании комбинированного инокулята, что свидетельствует о сочетаемости заквасочных культур и их взаимном стимулировании. Это, вероятно, объясняется высокой протеолитической активностью культуры L. helveticus, которая расщепляет белковые компоненты в питательной среде с образованием пептидов и аминокислот и создает благоприятные условия для роста пропионовокислых бактерий.

В результате проведенных исследований выбраны оптимальные технологические параметры производства бактериального концентрата с холестеринметаболизирующими свойствами. Характеристика концентрата представлена в таблице 2.

Из данных таблицы 2 видно, что концентрат обладает высокой холестеринметаболизирующей, ан-тимутагенной и адгезивной активностью, синтезирует экзополисахариды и содержит высокое количество жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов. Учитывая высокие пробиотические свойства концентрата в жидкой форме, его можно рекомендовать в качестве биологически активной добавки к пище для лечения и профилактики заболеваний, вызванных повышенным уровнем холестерина в крови.

Выводы

В результате проведенных исследований подобраны условия совместного культивирования P. shermanii AC 2503 и L. helveticus 3 5-1 и разработан комбинированный бакконцентрат в жидкой форме, обладающий высокими антимутагенными и холестеринметаболизирующими свойствами.