Влияние условий произрастания на активность аскорбинатоксидазы и полифенолоксидазы в листьях древесных растений

На сегодняшний день наблюдается возрастание степени антропогенного воздействия на живые системы. Крупные городские агломерации характеризуются комплексом неблагоприятных факторов среды обитания для живых организмов, включая древесные растения. Неравномерное распределение негативных факторов в пространстве способствует формированию локальных условий места произрастания, которые представлены особенностями рельефа, температурным режимом атмосферного воздуха, температурой поверхности почвы, параметрами отно- сительной влажности воздуха (Никерова и др., 2021; Samancioglu et al., 2016).

Растения в городской среде применяют разнообразные механизмы адаптации к негативным условиям внешней среды (Саму-сик и др., 2022; Kamath et al., 2015).

В научном сообществе сохраняется интерес к изучению особенностей адаптации древесных растений на молекулярном уровне к негативным стресс-факторам городской среды. Механизмы адаптации растений и формирование устойчивости древесных растений к разнообразным стрессам антропогенной среды изучались отечественными и зарубежными исследователями (Иванова и др., 2021; Робакидзе и др., 2021; Лубянова и др., 2021; Hyder et al., 2020).

Важным для жизнедеятельности клетки и всего растительного организма является медьсодержащий фермент класса оксидоредуктаз – полифенолоксидаза, которая выполняет функцию окисления фенольных соединений и участвует в дыхании. Полифе-нолоксидаза принимает участие в приспособительных реакциях к негативным факторам окружающей среды. Она относится к классу терминальных оксидаз растительной клетки, которая локализована в цитоплазме. Данный фермент принимает активное участие в дыхании растительных клеток за счет обратимого окисления полифенолов (Саут-кина, 2022; Nunes et al., 2019).

Другим важным ферментом, участвующим в формировании адаптивных реакций к антропогенным стрессам, является аскор-бинатоксидаза, которая принимает участие в ликвидации активных форм кислорода и защитных реакциях организма в борьбе с окислительным стрессом растительного организма. Аскорбинатоксидаза локализована в клеточной стенке и принадлежит суперсемейству мультимедных оксидаз (Garcia et al., 2016).

В научных исследованиях не достаточно полно изучено влияние локальных условий произрастания на формирование механизма адаптации на молекулярном уровне у древесных растений в городской среде. В связи с этим в условиях г. Набережные Челны изучение экофизиологических особенностей защитных древесных насаждений и древесных пород, связанных с синтезом веществ с антиоксидантной активностью, является актуальным.

Целью исследования являлось изучение влияния локальных условий места произрастания на активность аскорбинатоксидазы и полифенолоксидазы в листьях древесных растений, произрастающих в различных типах насаждений (на примере г. Набережные Челны).

Материалы

Исследования были проведены в период с 2015 по 2022 г. Объектами выступали аборигенные древесные растения клен остролистный ( Acer platanoides L.) и береза повислая ( Betula pendula Roth.). Объем выборки составлял 30 деревьев каждого вида с каждой пробной площади. Выбранные объекты произрастали в насаждениях разных экологических категорий: зона условного контроля – Челнинское лесничество, санитарно-защитные зоны – завод кузнечный ПАО «Камаз», магистральные насаждения проспекта Казанский (рис. 1).

Методы

На исследуемых территориях закладывались пробные площади размером не менее 0.25 га, в пределах которых произрастали выбранные древесные растения.

С целью определения особенностей динамики активности исследуемых ферментов с учетом уровня загрязнения окружающей среды и локальных условий места произрастания были определены два типа биотопов, которые отличались по микрорельефу и, как следствие, по абиотическим параметрам условий произрастания растений. Пробные площади на возвышенных, хорошо продуваемых участках, имеющих выровненную поверхность, были обозначены «биотоп 1». Пробные площади в пределах каждого типа насаждений на участках, имеющих понижение рельефа, были обозначены как «биотоп 2». Более высокие значения по относительной влажности воздуха и более низкие температуры почвы и атмосферного воздуха наблюдались в биотопе 2.

Для выделения локальных условий произрастания в каждой категории насаждений закладывались две пробные площади, которые отличались друг от друга по ряду параметров: степень увлажнения, температурный режим поверхности почвы, относительная влажность воздуха, особенности рельефа. Параметры условий отмечались в сухую и теплую погоду с целью фиксации максимальных отличий. Оценка гидротермического режима атмосферного воздуха проводилась на высоте 2 метров, с этой же высоты был осуществлен сбор листьев для последующего лабораторного анализа. Все наблюдения и сбор растительного матери-

Набережные Челны

Татарстан

Рис. 1. Карта-схема расположения пробных площадей: 1 – зона условного контроля Челнинское лесничество (биотоп 1); 2 – зона условного контроля Челнинское лесничество (биотоп 2); 3 – кузнечный завод (биотоп 1); 4 – кузнечный завод (биотоп 2); 5 – Казанский проспект (биотоп 1); 6 – Казанский проспект (биотоп 2)

Fig 1. The scetch map of the sample plots: 1 – conditional control zone of the Chelny forestry (biotope 1); 2 – conditional control zone of the Chelny forestry (biotope 2); 3 – blacksmith factory (biotope 1); 4 – blacksmith factory (biotope 2); 5 – Kazansky Prospekt (biotope 1); 6 – Kazansky Prospekt (biotope 2)

ала проводили в дневные часы, с 11 до 13 часов. Температуру поверхности почвы замеряли в 10 точках в непосредственной близости к растению в трехкратной повторности в течение дня (утром с 7 до 8 часов), в обед (с 12 до 14 часов) и вечером (с 17 до 18 часов), затем вычисляли среднюю арифметическую полученных трех значений (Методы..., 2014).

Суммарный показатель загрязнения почв Z рассчитывался с учетом коэффициентов концентрации загрязняющих веществ и числа загрязнителей n по формуле (СанПиН 1.2.3685-21).

Z=WW ^- ( n - !) ■

В зависимости от величины Z устанавливают следующие ранги загрязнения почв: допустимый (Z ≤ 16); умеренно опасный (Z = 16–32); опасный (Z = 32–128); чрезвычайно опасный (Z ≥ 128).

Индекс загрязнения атмосферы рассчитывался по формуле:

ИЗАi = (Сi/ПДКi)кi, где Сi – средняя концентрация i вещества. ПДК - среднесуточная предельно допустимая концентрация i вещества, ki - показатель степени, учитывающий класс опасности вещества - для веществ 1-го класса опасности – 1.5; 2-го – 1.3; 3-го – 1.0; 4-го – 0.85 (РД 52.04.667-2005).

Сбор растительного материала осуществлялся в летние месяцы, с учетных особей собирали по 30 листьев средней формации на годичном вегетативном побеге. Побеги располагались в нижней части кроны южной экспозиции. Определение активности медьсодержащих ферментов в листьях проводили в динамике в июне, июле и августе спектрофотометрически.

Активность аскорбинатоксидазы определяли по методу, предложенному Д. К. Аса-мовым и С. Т. Рахимовой (1987), который основан на свойстве аскорбиновой кислоты поглощать свет с максимумом при длине волны 265 нм. Об активности фермента судили по уменьшению величины оптической плотности, учитывая, что степень окисления аскорбиновой кислоты пропорциональна количеству фермента. Активность полифе-нолоксидазы определяли спектрофотометрическим методом, основанным на измерении оптической плотности продуктов реакции, которые образуются при окислении пирокатехина за определенный промежуток времени (Ермаков и др., 1987).

Математическую обработку осуществляли с использованием статистического пакета Microsoft Windows «Statistica 10». Распределение данных определяли с помощью построения ящичных диаграмм. В описательной статистике осуществляли проверку подгрупп на нормальность. Далее были построены частотные гистограммы (тест K-S, Shapiro-Wilk). С целью анализа полученных данных использовали методы дисперсионного многофакторного анализа ANOVA (при последующей оценке различий методом TuKey HSD test и Scheffe test). В процессе сравнения и анализа полученных результатов использовали уровень значимости (при p < 0.05).

Результаты

В пределах выделенных пробных площадей учитывались следующие параметры: степень увлажнения, температурный режим поверхности почвы, относительная влажность воздуха, особенности рельефа. Параметры условий отмечались в сухую и теплую погоду с целью фиксации максимальных отличий.

В насаждениях зоны контроля преобладают дерново-подзолистные почвы, суммарный показатель загрязнения почвы составил 8. Завод кузнечный в городе Набережные Челны имеет не полностью сформированную санитарно-защитную зону, которая большей частью расположена на юго-востоке города. Загрязнение почвы составляет 24 единицы. На данной территории фиксируются стабильно высокие значения атмосферного воздуха, индекс загрязнения атмосферного воздуха составляет 10.3 единицы. Казанский проспект является самой оживленной магистралью города Набережные Челны с высоким уровнем загрязнения атмосферного воздуха (ИЗА = 12.3). Суммарный показатель загрязнения почвы составляет 30–32. Среди приоритетных загрязнителей санитарно-защитных зон и магистральных посадок можно выделить следующие: формальдегид, фенол, оксиды азота и серы, бенз(а)пирен.

В ходе исследования была выявлена различная активность медьсодержащих ферментов на различный уровень загрязнения среды обитания и локальные условия места произрастания в пределах типа насаждений.

Дисперсионный многофакторный анализ результатов исследований выявил существенное влияние видовых особенностей (уровень значимости p < 10^-5), типа насаждения ( p < 10^-5), локальных условий места произрастания ( p < 10^-5), сроков вегетации ( p < 10^-5), а также взаимодействия этих факторов ( p < 10^-5) на активность аскобинатоксидазы и полифенолоксидазы в листьях древесных растений (табл. 1).

Обсуждение

Результаты проведенных исследований показали, что у березы повислой в контрольных насаждениях растения в биотопе 2 имели достоверно более высокие показатели активности фермента в листьях по сравнению с растениями биотопа 1: в июне на 0.42 ед. акт., в июле – на 0.34, в августе – на 0.52, при НСР05= 0.02.

В насаждениях санитарно-защитных зон промышленных предприятий у растений на пробной площади 2, наоборот, активность аскорбинатоксидазы в листьях была ниже, чем у растений биотопа 1.

В примагистральных посадках у березы повислой в биотопе 2 в июне и июле активность фермента в листьях была выше на 0.12 и 0.20 ед. акт. по сравнению с показателями биотопа 1, в августе ниже на 0.09 ед. акт. по сравнению с растениями биотопа 1.

У клена остролистного, произрастающего в насаждениях зоны условного контроля в биотопе 2, активность фермента в листьях в июне была ниже на 0.03 ед. акт., чем у растений в биотопе 1, а в августе выше на 0.10 ед. акт. В насаждениях санзон промышленных предприятий и примагистральных посадках у растений биотопа 2 по сравнению с биотопом 1 в начале наблюдений активность аскорбинатоксидазы в листьях была выше на 0.13 и 0.18 ед. акт. соответственно. К концу периода вегетации у растений биотопа 2 в насаждениях санитарно-защитных зон исследуемый показатель имел более низкие значения по сравнению с биотопом 1: в июле

Таблица 1. Результаты дисперсионного анализа по активности аскорбинатоксидазы в листьях древесных растений

df			df
Факторы	Effect	MS Effect	Error	MS Error	F	p -level
1*	4	35.91434	720	0.013327	2694.886	Р < 10-5
2	2	28.07945	720	0.013327	2106.9832	Р < 10-5
3	3	0.313938	720	0.013327	23.556828	Р < 10-5
4	2	15.39037	720	0.013327	1154.8389	Р < 10-5
12	8	8.644543	720	0.013327	648.65601	Р < 10-5
13	12	0.277375	720	0.013327	20.813242	Р < 10-5
14	8	7.983537	720	0.013327	599.05652	Р < 10-5
24	4	26.48736	720	0.013327	1987.5186	Р < 10-5
34	6	0.069637	720	0.013327	5.2252893	Р < 10-5
124	16	5.537092	720	0.013327	415.48389	Р < 10-5
134	24	0.11779	720	0.013327	8.8385468	Р < 10-5

Примечание. * 1 – вид растения; 2 – тип насаждения; 3 – локальные условия произрастания; 4 – срок вегетации.

Таблица 2. Результаты дисперсионного анализа по активности полифенолоксидазы в листьях древесных растений

df			df
Факторы	Effect	MS Effect	Error	MS Error	F	p -level
1	4	20.48512	180	0.079447	257.8463	Р < 10-5
2	2	37.52496	180	0.079447	472.3267	Р < 10-5
3	3	0.110002	180	0.079447	1.384593	0.004
4	2	227.2249	180	0.079447	2860.08	Р < 10-5
12	8	0.460347	180	0.079447	5.794383	Р < 10-5
13	12	0.155704	180	0.079447	1.959843	0.030
14	8	6.081296	180	0.079447	76.54528	Р < 10-5
24	4	7.762559	180	0.079447	97.70734	Р < 10-5
34	6	0.142807	180	0.079447	1.797517	0.002
124	16	0.58235	180	0.079447	7.330036	Р < 10-5
134	24	0.133702	180	0.079447	1.682911	0.030

– на 0.41, в августе – на 0.18. ед. акт. У растений биотопа 2 в примагистральных посадках, наоборот, показатели активности фермента были выше, чем в биотопе 1: в июле – на 0.49, в августе – на 0.15 ед. акт. В насаждениях санитарно-защитных зон различия наблюдались лишь в июле: активность аскорбинатоксидазы у растений в биотопе 2 была достоверно выше на 0.03 ед. акт., чем в биотопе 1.

В результате сравнения достоверных результатов было отмечено, что общей закономерности в реакции и изменении активности аскорбинатоксидазы в листьях изучаемых древесных растений на комплексное влияние уровня загрязнения и локальных условий произрастания выявить не удалось. Береза повислая и клен остролистный про- являли видовую специфику в активности аскорбинатоксидазы в листьях.

В результате проведенного сравнительного анализа активности полифенолоксидазы были отмечены различия у растений, произрастающих в условиях пробных площадей. Во всех типах насаждений у всех особей, произрастающих в биотопе 2, в течение всего периода наблюдений была зафиксирована достоверно (НСР05 = 0.04 ед. акт.) более высокая активность полифенолоксидазы в листьях по сравнению с биотопом 1: в контрольных насаждениях в июне – на 0.22, июле – на 0.10, а в августе – на 0.16 ед. акт.; в насаждениях санитарно-защитных зон в июне – на 0.14, в июле – на 0.11, в августе – на 0.11 ед. акт.; в примагистральных по-

Таблица 3. Активность медьсодержащих ферментов в листьях древесных растений г. Набережные
		Челны, для проб из n = 30
Вид	Тип насаждений	Месяц	Биотоп	Активность	Активность
растения				аскорбинатоксидазы	полифенолоксидазы
		Июнь	1	3.13 ± 0.51	1.31 ± 0.09
			2	3.55 ± 0.14	1.36 ± 0.13
	Зона условного	Июль	1	3.48 ± 0.36	3.48 ± 0.38
	контроля		2	3.82 ± 0.34	3.76 ± 0.41
		Август	1	4.21 ± 0.26	1.76 ± 0.11
			2	4.73 ± 0.17	1.96 ± 0.18
		Июнь	1	3.38 ± 0.22	1.22 ± 0.07
			2	3.08 ± 0.17	1.31 ± 0.09
B. pendula	Санитарно-	Июль	1	3.15 ± 0.33	2.47 ± 0.14
	защитные насаждения		2	2.86 ± 0.32	2.57 ± 0.17
		Август	1	2.60 ± 0.27	3.85 ± 0.28
			2	2.61 ± 0.19	4.03 ± 0.37
		Июнь	1	3.00 ± 0.31	1.26 ± 0.09
			2	3.12 ± 0.23	1.39 ± 0.14
	Магистральные	Июль	1	2.53 ± 0.17	2.54 ± 0.24
	посадки		2	2.73 ± 0.21	2.53 ± 0.27
		Август	1	2.01 ± 0.12	3.96 ± 0.31
			2	1.92 ± 0.09	4.07 ± 0.42
		Июнь	1	3.45 ± 0.26	0.90 ± 0.13
			2	3.42 ± 0.35	0.98 ± 0.17
	Зона условного	Июль	1	3.97 ± 0.29	2.96 ± 0.26
	контроля		2	3.98 ± 0.41	3.08 ± 0.36
		Август	1	4.56 ± 0.39	1.76 ± 0.09
			2	4.66 ± 0.42	1.87 ± 0.16
		Июнь	1	3.76 ± 0.27	1.03 ± 0.09
			2	3.89 ± 0.36	1.36 ± 0.11
A.	Санитарно-	Июль	1	3.29 ± 0.31	3.01 ± 0.32
platanoides	защитные насаждения		2	2.88 ± 0.11	3.34 ± 0.36
		Август	1	2.48 ± 0.27	3.41 ± 0.38
			2	2.30 ± 0.19	3.66 ± 0.33
		Июнь	1	3.77 ± 0.36	1.02 ± 0.12
			2	3.95 ± 0.39	1.32 ± 0.21
	Магистральные	Июль	1	2.93 ± 0.26	3.30 ± 0.28
	посадки		2	3.42 ± 0.31	3.67 ± 0.42
		Август	1	2.51 ± 0.18	4.79 ± 0.47
			2	2.66 ± 0.25	5.07 ± 0.31
	НСРП5			0.02	0.04

садках в июне – на 0.12, в июле – на 0.10, в августе - на 0.16 ед. акт. Эти данные свидетельствуют о том, что на активность антиоксидантной системы оказывает влияние не только уровень загрязнения окружающей среды, но и особенности локальных условий произрастания растений. Аскорбинатоксидаза участвует в каталитическом окислении аскорбиновой кислоты до монодегидроаскорбата, который быстро превращается в дегиброаскорбино-вую кислоту. Обратимость данных реакций обеспечивает возможность растениям формировать специфическую реакцию в условиях стресса и поддерживать окислительно-восстановительное состояние апопласта (Garchery et al., 2008), которое меняется при воздействии стрессовых факторов окружающей среды, в т. ч. и антропогенного, который представлен комплексом загрязня- ющих веществ (Garchery et al., 2013). В наших исследованиях береза повислая и клен остролистный, произрастающие в условиях средней (санитарно-защитные насаждения) и высокой (магистральные насаждения) степени антропогенной нагрузки, снижали активность аскорбинатоксидазы к концу периода активной вегетации. При этом у растений в биотопе 1 активность фермента была выше по сравнению с растениями в биотопе 2 только в насаждениях со средней степенью антропогенной нагрузки, а в условиях сильной антропогенной нагрузки тенденция была противоположной. Данный факт подтверждает влияние локальных условий произрастания на активность аскорбина-токсидазы у аборигенных видов растений и формирование специфической адаптационной стратегии в условиях антропогенного стресса.

У березы повислой и клена остролистного независимо от типа насаждения и периода наблюдений особи в биотопе 2 имели достоверно более высокие показатели активности полифенолоксидазы в листьях по сравнению с биотопом 1.

На сегодняшний день активность поли-фенолоксидазы в листьях древесных растений слабо освещена в научной литературе. Встречаются сведения о ее роли в антиокси- дантной системе защиты растений, а также в участии в процессах вторичного метаболизма, подчеркивается специфическая линия защиты с выполнением особых функций в окислительном процессе растения (Vatankhah et al., 2010; Guo et al., 2014). В работах отмечается тенденция к возрастанию активности полифенолоксидазы в листьях древесных растений, произрастающих в условиях антропогенной среды, к концу периода вегетации (Заплатин, 2008), что подтверждается и в наших исследованиях, при этом уделяется мало внимания роли локальных условий произрастания.

Заключение

Активность фермента полифенолоксида-зы в листьях изучаемых видов древесных растений в августе имела достоверно более высокие значения в городских насаждениях в отличие от контрольных. По активности аскорбинатоксидазы реакция исследуемых видов специфична. Общей закономерности в реакции и изменении активности аскор-бинатоксидазы в листьях изучаемых аборигенных видов древесных растений на комплексное влияние уровня загрязнения и локальных условий произрастания выявить не удалось, а по показателю активности поли-фенолоксидазы реакция у березы повислой и клена остролистного схожая.