Влияние внутривлагалищного введения мелатонина в период индукции половой охоты у коров на показатели антиоксидантной защиты и оплодотворяемость

Введение. Процесс размножения у животных – это сложно регулируемый механизм, в который вовлечены многие системы организма. Немаловажную роль в обеспечении воспроизводительной функции играет гормон мелатонин, который способен регулировать циркадные ритмы, работу эндокринной системы и репродуктивных органов [1, 2, 3].

Хорошо известно значение гормона шишковидной железы в проявлении полового поведения у сезонных млекопитающих, размножающихся как в длинный, так и в короткий световой день. Мелатонин снижает окислительный стресс, так как способен стимулировать активность антиоксидантных ферментов, таких как, глутатионпероксидаза и каталаза [4, 5]. Снижая эффект окислительного стресса, мелатонин действует, повышая антиоксидантную защиту, во время роста фолликула он снижает или нейтрализует активные формы кислорода в тканях яичника, защищая ооцит и гранулезные клетки от повреждения, что положительно влияет на процесс оплодотворения [6, 7]. В связи с этим, применение мелатонина в период гормональной стимуляции половой охоты и овуляции, для нормализации антиоксидантного статуса животных может улучшить результативность искусственного осеменения [8].

Цель работы – изучить влияние внутривлагалищного введения мелатонина на показатели антиоксидантной защиты организма коров и их оплодотворяемость в результате искусственного осеменения после гормонально индуцированной половой охоты и овуляции.

Условия, материалы и методы. Объектом исследования служили клинически здоровые лактирующие коровы красно-пёстрой породы 2–4 лактации, содержащиеся привязно, в четырехрядном коровнике. На момент исследования средняя молочная продуктивность была – 24 литра в день; количество дней в доении составляло в среднем 120-125. Основу кормления составляли сено, силос, а также концентрированные корма. В опыт были включены коровы не оплодотворившиеся при первичном и повторном осеменении в гормонально индуцированную охоту. Животные были распределены на 4 группы по принципу пар аналогов по 8–9 голов в каждой. Для синхронизации половой охоты и овуляции всем животным применялся протокол Ovsynch включающий назначения гонадолиберина (25 мкг аларелин ацетата) в начале программы и применения простагландина F2α (500 мкг клопростенола в/м) через 7 дней, а также стимуляцию овуляции последующим введением аларелина (через 56 часов после инъекции простагландина). В качестве гонадолиберина использовался препарат Сурфагон от компании ООО «НПК Асконт+», а простагландина F2a - Эстрофан, от АО «Биовета». Дополнительно к инъекциям гормональных препаратов всем животным апплицировали силиконовые внутривлагалищные имплантаты собственной разработки, при этом животным контрольной группы (n=9) назначили препарат содержащий только 1,75 г. прогестерона, а коровам трёх опытных групп: первая (n=8), вторая (n=8), и третья (n=9) с добавлением разных дозировок мелатонина: 300 мг, 500 мг и 700 мг соответственно, импланты извлекали спустя 7 дней.

Для оценки состояния системы ПОЛ-АОЗ у 3-х животных каждой группы брали кровь за сутки до введения гормонсодержащих систем во влагалище и повторно на 10 день гормональной программы, перед искусственным осеменением. Проводили исследование показателей малонового диальдегида (МДА), глутатион пероксидазы (ГПО) и каталазы в цельной крови. Исследованияпроводились в соответствии с «Методическими положениями по изучению процессов свободнорадикального окисления и системы антиоксидантной защиты организма» (2010) [9]. Концентрацию витамина Е определяли в соответствии с «Методическими рекомендациями по применению биохимических методов исследования крови животных» (2005) [10]. Кровь для исследования уровня мелатонина в организме животных получали в 6 часов утра, в 0, 1, 4, 7 дни гормональной программы. Исследование полученной сыворотки на содержание гормона шишковидной железы проводилось методом иммуноферментного анализа с помощью набора готовых реактивов «CEA908 GeTests Enzyme-linkedimmunosorbent Assay Kit For Melatonin (MT)» от CloudCloneCorp на микропланшетном фотометре AMR-100T при длине волны 450 нм. Для оценки влияния предлагаемого способа введения антиоксиданта на оплодотворяемость проводили УЗИ диагностику стельности на 30 день после искусственного осеменения. Полученные данные были статистически обработаны с помощью компьютерного ПО Microsoft Office (Microsoft Excel) с учетом средних (M) и стандартных ошибок (m).

Результаты их обсуждение. Для определения эндогенной концентрации мелатонина в 0 день, перед введением имплантатов в 6 часов утра у 12 коров брали пробы крови. Изменение уровня данного пептида регистрировали, в то же время в 1, 4 и 7 дни после аппликации внутривлагалищных систем. В таблице 1 представлены сведения об изменении концентрации мелатонина в организме у подопытных животных из разных групп.

Согласно данным таблицы 1 исходная концентрации мелатонина до аппликации имплантов в 6 часов утра (0 день) у всех животных была 73,84 ± 9,54 пг/мл. В контрольной группе уровень исследуемого гормона в период наблюдений не менялся и не отличался значительно от исходного значения.

Применение мелатонин содержащих имплантатов с дозировкой 300 мг (табл.1) первые сутки вызвало увеличение уровня антиоксидантного гормона в1,7 раза до 129,11±26,77 пг/мл. Максимальная концентрация, в 2 раза выше, чем в контрольной группе, была достигнута к 4 дню и составила 149,00±17,65 пг/мл. Было отмечено, что значения содержания мелатонина в организме коров первой группы в 1 и 4 дни имели достоверную разницу (p ≤ 0,05) в сравнении с контролем – 74,20 ± 18,11 и 71,63 ± 20,98 пг/мл. К 7 дню эффектность действия препарата(Мт=300 мг)значительно снизилась, так концентрация мелатонина была выше начального уровня всего в 1,3 раза, достигнув 96,70 ± 5,19 пг/мл.

Таблица 1 – Изменения концентрации мелатонина в период индукции половой охоты у подопытных коров в зависимости от применённой дозировки, М±m.

Группы (дозировки мелатонина)	День взятия крови в период синхронизации
	0 (Исход. фон)	1	4	7
	Концентрация мелатонина, пг/мл
Первая	73,84±9,54	129,11± 26,77*	149,00±17,65*	96,70±5,19
Вторая n=3		150,65 ±27,56*	177,00±17,65**	106,35±7,09*
Третья n=3		250,31±22,15 ***	228,51 ±26,73**	146,34 ±19,52 **
Контроль n=3		74,20±18,11	71,63 ±20,98	72,73 ±15,53

Примечание: * - Р <0,05; ** - Р <0,01; *** - Р <0,01

Введение 500 мг мелатонина в составе имплантатов в первый сутки увеличило его концентрацию в сыворотке крови до 150,65 ± 27,56 пг/мл, что в 2 раза превысило уровень этого показателя в контрольной группе(74,20 ± 18,11 пг/мл) (p ≤ 0,05). На 4 день содержание данного пептида в организме коров второй группы(Мт=500 мг)достигло максимума – 177,00 ± 17,65 пг/мл и было в 2,4 раза больше, чем в это же время в группе контроля - 71,63 ± 20,98 пг/мл(p ≤ 0,01).К 7 дню концентрация мелатонина снизилась до106,35 ± 7,09 пг/мл, но по-прежнему была выше фонового уровня в 1,4 раза и значимо выше(p ≤ 0,05)показателя контрольной группы –72,73 ± 15,53 пг/мл.

Через сутки после введения внутривлагалищных систем с 700 мг мелатонина его содержание в организме коров третьей группы увеличилось в до 250,31 ± 22,15 пг/мл, что стало максимальным уровнем и статистически превышало (p ≤ 0,001) значения контрольной группы – 74,20±18,11 пг/мл в 3,4 раза. На 4 и 7 дни концентрация исследуемого пептида превышала исходный уровень в 3,1 и 2 раза, так показатели составили 228,51 ± 26,73 и 146,34 ± 19,52 пг/мл соответственно, при этом они имели высокое достоверное отличие (p ≤ 0,01) от значений контроля– 71,63 ± 20,98 и 72,73 ± 15,53 пг/мл.

Таким образом, наблюдение в течение 4 дней показало, что все образцы имплантов, с разными дозировками мелатонина введённые во влагалище, обеспечили его повышенный уровень в организме коров. К 7 дню, в группах которым вводили 300 и 500 мг гормона шишковидной железы, его концентрация в 6 часов утра превышала начальный фон и значения контрольной группы менее чем в 1,5 раза. Сохранение самой высокой концентрации мелатонина в организме животных в течение 7 дней обеспечили имплантаты содержащие 700 мг. В третьей группе(Мт=700 мг)содержание данного пептида каждый раз превышало исходный фон и контрольные значения более чем в 2 раза.

Анализ некоторых показателей системы ПОЛ-АОЗ и содержания витамина Е в контрольной и опытных группах до и после применения имплантатов (табл. 2) подтвердил биологическую эффективность мелатонина как антиоксиданта. Так, действие данного пептида в составе гормон-высвобождающих систем качественно повлияло на нейтрализацию продуктов перекисного окисления липидов и показатели активности звеньев антиоксидантной защиты в период гормональной индукции половой охоты.

Таблица 2 – Некоторые показатели системы ПОЛ-АОЗ и содержания витамина Е у подопытных животных до и после применения имплантов, М±m.

Показатели	Норм. значения	Фон (0 день)	После применения (10 день), Группы (n=3) (дозировки мелатонина)
			Первая (Мт 300 мг)	Вторая (Мт 500 мг)	Третья (Мт 700 мг)	Контроль
Малоновый диальдегид (МДА), мкмоль/л	0,8–1,2	1,21±0,06	1,28±0,44	1,18±0,26	1,02±0,25*	1,54±0,07
Глутатионпе роксидаза (ГПО), мкмоль вост. глут./л*мин* 103	20,0–35,0	43,29±2,35	43,73±5,60	44,00±4,37	40,65±4,09	43,55±3,05
Каталаза, мкмоль вост. перекиси/л*м	30,0–40,0	43,50±2,81	40,02±4,16	39,53±6,23	39,30±5,46	43,15±4,86
Витамин Е, мкМ/л	10,8–25,0	12,88±0,74	13,27±2,80	14,10±0,79	14,23±1,11	12,20±1,75

Примечание: * - Р <0,05.

В результате анализа данных таблицы 2, было установлено, что у подопытных животных наблюдалось усиление напряжения метаболических процессов в начале эксперимента. До применения гормон содержащих имплантатов показатель интенсивности перекисного окисления липидов – малоновый диальдегид (МДА) находился в пределах верхних значений физиологической нормы – 1,21±0,06 мкмоль/л. Одновременно с тем,отмечалась повышенная интенсивность антиоксидантных механизмов защиты, носящих компенсаторный характер. Активность ферментов глутатионпероксидазы (ГПО) и каталазы, также была превышена. Исходная концентрация фермента ГПО составляла – 43,29±2,35мкмольвостглут. /л*мин* 103,а каталазы –43,50±2,81 мкмольвост перекиси/л*мин.

К 10 дню эксперимента, когда проводили искусственное осеменение, в группе, где антиоксидант мелатонин не применялся показатель перекисного окисления МДА относительно исходного значения повысился на 27,3 % до 1,54±0,07 мкмоль/л. Ферменты антиоксидантной защиты сохранили высокую активность, так концентрация ГПОсоставила43,55±3,05 мкмоль вост. глут. /л*мин* 103, а каталазы 43,15±4,86 мкмоль вост. перекиси/л*мин. Таким образом, в контрольной группе отмечалось усиление процессов свободнорадикального окисления и сохранение высокой мощности ферментов антиоксидантной защиты.

Имплантаты содержащие 300 мгмелатонина, применённые в первой группе, оказались не эффективны в отношении нормализации процессов перекисного окисления. Так, концентрация МДА в первой группе к 10 дню повысилась на 5,8 % и составила 1,28±0,44 мкмоль/л. Фермент ГПО сохранил высокую активность – 43,73±5,60 мкмоль вост. глут./л*мин* 103, а уровень каталазы установился на верхних пределах физиологических значений снизившись на 8,7 % до 40,02±4,16 мкмоль вост. перекиси/л*мин.

500 мг мелатонина позволило стабилизировать течение метаболических процессов на прежнем уровне, так к 10 дню во второй группе концентрация МДА осталась в пределах верхней границы нормальных значенийсоставив1,18±0,26 мкмоль/л. Фермент ГПО сохранил высокую активность – 44,00±4,37 мкмоль вост. глут./л*мин* 103. Показатель каталазы установился в верхних пределах физиологических значений снизившись на 9,1% до 39,53±6,23мкмоль вост. перекиси/л*мин.

Применение внутривлагалищных систем содержащих 700 мг мелатонина позволило значительно снизить у животных в третьей группе уровень интенсивности перекисного окисления липидов перед искусственным осеменением. К 10 дню показатель МДА относительно исходного уровня уменьшился на 15,7 % до 1,02±0,25* мкмоль/л, что оказалось статистически ниже (на 40,6%), чем в контрольной группе, где показатель составил 1,54±0,07 мкмоль/л. Одновременно со снижением уровня продуктов окисления, наблюдалась и коррекция активности антиоксидантных ферментов, что указывает на положительную динамику в регуляции состояния метаболических процессов в организме коров из третьей группы. Так, концентрация ГПО снизилась на 6,1%до 40,65±4,09 мкмоль во ст глут./л*мин*103, при этом фермент сохранил высокую активность, по-прежнему превышая нормальные показатели. Уровень каталазы уменьшился на 9,7% до 39,30±5,46 мкмоль вост. перекиси/л*мин, достигнув пределов нормальных значений.

Содержание витамина Е в организме подопытных животных в начале эксперимента было приближен к нижним границам физиологической нормы и составляло12,88±0,74мкМ/л, что могло свидетельствовать о значительной активности неферментативного звена антиоксидантной защиты в процессе компенсации повышенной оксидативной нагрузки. После применения внутривлагалищных имплантатов, без мелатонина в контрольной группе наблюдалось снижение концентрации токоферола на 5,3% до 12,20±1,75 мкМ/л, что, по-видимому, объясняется его расходом в процессах ограничения интенсивности перекисного окисления липидов. В первой группе, после введения 300 мг мелатонина, содержание витамин Е в организме коров практически не изменилось, составив 13,27±2,80 мкМ/л. Назначение 500 и 700 мг антиоксидантного гормона обеспечило незначительное увеличение неферментативного показателя ПОЛ-АОЗ на 9,5% и на 10,5%, до 14,10 ± 0,79 и до 14,23 ± 1,11 мкМ/л соответственно. Полученные данные свидетельствуют о меньшем включении витамина Е в процесс нейтрализации продуктов окисления при применении мелатонина в дозировках 500 и 700 мг.

Таким образом, качественная коррекция метаболического напряжения была достигнута действием 700 мг мелатонина в течение семи дней. Концентрация 500 мг, также оказывала положительное влияние на антиоксидантный профиль, на это указывает изменение содержания витамина Е, и способствовала стабилизации уровня оксидативного стресса, на прежних значениях, согласно анализу ферментов ГПО, каталазы и уровня оксидативного показателя МДА.

Известно, что повышенный уровень метаболического стресса, накопление продуктов окисления оказывает повреждающее воздействие на репродуктивные органы у коров, что приводит к нарушениям их функций, к ухудшению показателей продуктивности[2,3,7], применение мелатонина, в составе прогестерон содержащих внутривлагалищных имплантов, при проведении синхронизации половой охоты, способствует нормализации физиологических процессов в организме животных, что было подтверждено улучшением оплодотворяемости (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние мелатонина на оплодотворяемость по результатам УЗИ на 30 день после осеменения.

Группа     (дозировка мелатонина)	Кол-во осемененных животных	Кол-во оплодотворившихся животных
		голов	%
Контрольная	9	4	44,5
Первая (Мт 300 мг)	8	4	50,0
Вторая (Мт 500 мг)	8	5	62,5
Третья (Мт 700 мг)	9	7	77,8

Напряжённое течение метаболизма угнетало функцию воспроизводительной системы коров, что вызвало снижение процента стельных животных, определяемых на 30 день после искусственного осеменения. Так, согласно данным таблицы 3, в контрольной группе, где гормон антиоксидант не применялся, был самый низкий уровень оплодотворяемости, составляющий 44,5%. Имплантаты содержащие 300 мг мелатонина, назначенные первой группе, не обеспечили коррекцию оксидативного стресса, показатель стельности в этой группе не превысил 50,0%. Стабилизации течения метаболических процессов способствовало применение 500 мг антиоксидантного компонента в составе влагалищных систем, во второй группе оплодотворяемость составила 62,5%. Качественное снижение интенсивности оксидативной нагрузки на организм коров было достигнуто в третьей опытной группе, там результативность осеменения достигла 77,8%, что оказалось на 33,3% выше, чем в группе контроля, это, по-видимому, было обусловлено наиболее высокой концентрацией и биологической активностью мелатонина, создаваемой в организме после аппликации имплантатов содержащих 700 мг данного пептида.

Выводы. Таким образом, применение дозировки 700 мг мелатонина в составе внутривлагалищных имплантов, используемых в программах гормонально индуцированной охоты и овуляции, создаёт достаточную биологическую активность для проявления антиоксидантного воздействия и коррекции уровня метаболического напряжения в организме высокопродуктивных коров, что обеспечивает повышение показателя оплодотворяемости на 33,3%.