Внутрипопуляционная изменчивость заразихи, поражающей подсолнечник в России, выявляемая микросателлитными маркерами

Введение. Заразиха, поражающая подсолнечник ( Orobanche cumana Wallr.), – растение-паразит, в настоящее время расценивается как один из самых опасных факторов, влияющих на производство этой культуры во многих странах, где она произрастает. Образование новых, вирулентных рас заразихи происходит по мере создания и введения в производство устойчивых сортов и гибридов подсолнечника [1].

В связи с этим практический интерес представляют собой знания о процессах, происходящих в популяциях паразита. Информация о структуре популяций паразита и динамике их изменчивости помогает селекционерам в выработке стратегии борьбы с ним. Отвечая на потребность практической селекции в новых знаниях о развитии популяций заразихи в отличающихся регионах возделывания подсолнечника, ученые разных стран проводят исследования генетического разнообразия внутри и между популяциями О. cumana с использованием различных типов молекулярных маркеров.

G. Gagne с соавторами [2] изучали генетическое разнообразие у восьми популяций этого вида заразихи из нескольких стран, используя RAPD-маркеры. Они определили большую межпопуляционную и слабую внутрипопуляционную изменчивость, сделали вывод о существовании двух основных генофондов: один объединяет популяции из Восточной Европы, другой включает популяции из Южной Испании. R. Pineda-Martos с соавторами [3] определены два основных генофонда О. cumana в Испании, состоящие из популяций из долины Гвадалквивир (Южная Испания) и провинции Куэнка (Центральная Испания) соответственно. Обе группы были генетически далеки, но внутри- и межпопуляционная изменчивость были в целом крайне низки внутри каждого генофонда. Тем не менее некоторое число популяций показало большее генетическое разнообразие, которое было связано с перекрёстным опылением между особями из обоих генофондов. Молекулярно-генетическая вариабельность популяций заразихи изучалась также в Молдавии и Турции [4; 5].

В наших работах [6; 7; 8] была изучена генетическая изменчивость между популяциями заразихи O. cumana , паразитирующей на подсолнечнике в России, Румынии и Казахстане с использованием различных типов молекулярных маркеров. Была обнаружена небольшая дифференциация между популяциями из стран бывшего СССР и Румынии, независящая от их расового состава.

Целью настоящего исследования было изучение дискриминационного потенциала системы микросателлитных маркеров для определения внутрипопуляционной изменчивости О. cumana, паразитирую- щей на подсолнечнике в России, анализ генетического разнообразия, структуры, степени сходства и различия современных её популяций и их сравнение с популяциями из Испании и Румынии.

Материалы и методы. Зрелые семена O. cumana восьми популяций были собраны в 2003–2014 гг. на полях подсолнечника в Краснодарском, Ставропольском краях и Ростовской области России, а также в провинции Кордова в Испании и Калараши в Румынии и хранились при -18 ^оС. Для определения расового состава популяций пользовались методикой, описанной в 2014 г. в нашей работе [6]. Для анализа использовали молодые цветоносы заразихи с корней растений подсолнечника сорта ВНИИМК 8883, восприимчивого ко всем современным расам заразихи. Для изучения внутрипопуляци-онного разнообразия в качестве матрицы для амплификации ПЦР была использована ДНК из 10 индивидуальных, случайно отобранных растений.

ДНК выделяли из замороженных цветоносов по методике J.J. Doyle и J.L. Doyle [9] с нашими модификациями. Для проведения полимеразной цепной реакции использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мM сульфата аммония; 1,5–3 мM MgCl 2 ; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (Москва, Сибэнзим). Для амплификации применяли термоциклер S1000^тм (BioRad, США). Условия амплификации: начальная денатурация при 96 ^оС в течение 2 мин, затем 30 циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 60 ^оС в течение 40 с, элонгация – 1 мин при 70 ^оС, денатурация при 94 ^оС – 30 с, финальная элонгация – 2 мин. Использовали 12 SSR (simple sequence repeat) праймеров, которые были отобраны нами ранее [6].

Электрофорез продуктов амплификации проводили в полиакриламидном геле

(8 %, 1 х ТБЕ) с использованием камеры VE-20 для вертикального электрофореза (Хеликон, РФ) при 100 V. Последующее окрашивание осуществляли бромистым этидием. Визуализация результатов электрофореза с помощью ультрафиолетового излучения и их документирование обеспечивались при помощи системы цифровой документации видеоизображения BIO-PRINT (Vilber Lourmat, Франция). В качестве маркера молекулярного веса использовался 100-bp DNA ladder (Thermo Fisher Sciencific Inc, Lithuania). Подсчет размеров фрагментов после электрофореза был выполнен при помощи программного обеспечения Bio-Capture (Vilber Lourmat, Франция).

Индекс полиморфного содержания (PIC) [10] и эффективное число аллелей (n e ) [11] для всех популяций в целом вычисляли по формулам:

PICi =1-∑ 1=1^р ij ² , (1)

где – Р частота j паттерна для локуса i и суммирование распространяется на n паттернов;

n e =1/ ∑ 1=1^р ij ² , (2)

Основные показатели генетической изменчивости популяций (число аллелей на локус Na , эффективное число аллелей Ne , полиморфность Р , наблюдаемая Но и ожидаемая Не гетерозиготность, информационный индекс Шеннона I ), а также анализ молекулярной вариансы АMOVA (Analysis of Molecular Variance), показатели F статистики Райта, генетические дистанции и генетическое сходство по Нею определяли с помощью программы GenAlЕx 6.5 [12].

Результаты и обсуждение. В результате идентификации расового состава популяций заразихи для каждого изучаемого варианта были определены расы, преобладающие в образце семян (табл. 1). Наименее вирулентная раса Е была выявлена в образце семян заразихи, собранных в окрестностях станицы Привольная Краснодарского края в 2003 г. Также раса Е встречалась в образце семян, собранных в Ростовской области, в Азовском районе в 2012 г. Здесь же присутствовали также расы F и G. Только раса F была обнаружена в популяции заразихи из провинции Кордоба, Испания. В остальных популяциях преобладали расы F и G. В образцах семян из Новоалександровского ГСУ (Ставропольский край) и Калараши (Румыния), кроме выше указанных рас, встречалась и раса H. В общем расовый состав семян заразихи из разных популяций отличался разнообразием.

Таблица 1

Характеристика образцов O. cumana, использованных для анализа

Место сбора семян заразихи	Страна	Год сбора	Расы, преобладающие в образце семян
Ростовская область, Кагальницкий район	Россия	2012	G
Краснодарский край, ст. Привольная	Россия	2003	E
Ставропольский край, ГСУ Новоалександровск	Россия	2014	F, G, H
Волгоградская область, Новоаннинский район	Россия	2013	F, G
Краснодарский край, Крыловский район	Россия	2012	G
Ростовская область, Азовский район	Россия	2012	E, F, G
Калараши	Румыния	2014	F, G, H
Кордоба	Испания	2014	F

Из 12 микросателлитных праймеров, использованных в работе, были отобраны 10, показавшие полиморфизм амплифици-рованных фрагментов ДНК. В результате амплификации десяти микросателлитных локусов у заразихи из восьми популяций было выявлено 22 аллеля, от 2 до 4 аллелей на локус. Для определения дискриминационного потенциала использованной системы маркеров были вычислены наблюдаемое и эффективное число аллелей и индекс полиморфного информационного содержания (PIC) по всем популяциям в целом (табл. 2).

Характеристика 10 микросателлитных локусов ДНК, использованных для оценки внутрипопуляционных генетических различий восьми популяций O. cumana

Локус	Размер фрагмента ДНК (пн)	Количество аллелей	Эффективное число аллелей	PIC*
Ocum-52	114, 131	2	1,92	0,48
Ocum-59	90, 100	2	2,00	0,50
Ocum-70	120,127	2	2,00	0,50
Ocum-81	72, 90	2	1,54	0,35
Ocum-87	132, 136, 134,138	4	2,77	0,64
Ocum-108	144, 152	2	2,00	0,50
Ocum-141	186, 191	2	1,92	0,48
Ocum-196	192, 197	2	2,00	0,50
Ocum-197	104, 113	2	1,92	0,48
Ocum-174	186, 190	2	1,11	0,10
Среднее		2,2	1,91	0,45

*PIC – индекс полиморфного информационного содержания

Среднее число аллелей на локус для использованной системы маркеров составило 2,2. Показатели эффективного числа аллелей варьировали от 1,11 у локуса Ocum-174 до 2,77 у Ocum-87, со средним значением 1,91. Средняя величина эффективного числа аллелей немного ниже, чем среднее число аллелей по всем популяциям, что согласуется с результатами популяционных исследований у других видов животных и растений. Полученные величины PIC находились в диапазоне от 0,10 у локуса Ocum-174 до 0,64 у Ocum-87. Среднее значение индекса полиморфного информационного содержания для изученной группы генотипов 0,45, что свидетельствует о достаточной информативности используемой маркерной системы. Наиболее высокий полиморфизм у изученных популяций выявила праймерная пара Ocum-87.

При изучении внутрипопуляционного генетического разнообразия было установлено, что процент полиморфных локусов для каждой российской популяции составил от 40 у привольненской до 80 у кагальницкой и крыловской (табл. 3). В сравнении с популяциями из России у популяций из Испании и Румынии – 0 и 20 % соответственно. В среднем процент полиморфных локусов составил 50.

Таблица 3

Основные показатели генетического разнообразия популяций O. cumana, выявленные по десяти микросателлитным локусам ДНК

Популяции	Na	Ne	I	Ho	He	% P
Кагальницкая	1,80 ± 0,13	1,60 ± 0,12	0,49 ± 0,08	0,05 ± 0,02	0,34 ± 0,06	80
Привольненская	1,40 ± 0,16	1,14 ± 0,06	0,16 ± 0,07	0,04 ± 0,02	0,09 ± 0,04	40
Новоалександ-	1,70 ±	1,46 ±	0,39 ±	0,01 ±	0,27 ±	70
ровская	0,15	0,12	0,09	0,01	0,06
Новоанненская	1,70 ± 0,30	1,35 ± 0,14	0,30 ± 0,12	0,00 ± ,00	0,19 ± 0,07	50
Крыловская	2,00 ± 0,25	1,64 ± 0,18	0,50 ± 0,11	0,00 ± 0,00	0,32 ± 0,06	80
Азовская	1,60 ± 0,16	1,34 ± 0,13	0,30 ± 0,09	0,11 ± 0,04	0,20 ± 0,06	60
Кордоба	1,0  ± 0,00	1,0 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0,00 ± 0,00	0
Калараши	1,20 ± 0,13	1,16 ± 0,11	0,12 ± 0,08	0,02 ± 0,02	0,09 ± 0,06	20

Примечание: Na – число аллелей на локус; Ne – эффективное число аллелей; I – информационный индекс Шеннона; Ho – наблюдаемая гетерозиготность; He – ожидаемая гетерозиготность; % P – процент полиморфных микросаттелитных локусов

Отдельно для каждой популяции были вычислены основные показатели их генетической изменчивости, а также молекулярная варианса АMOVA (Analysis of Molecular Variance), F статистика Райта и генетические дистанции и сходство по Нею.

Анализ генетической изменчивости для российских популяций показал, что число аллелей на локус колебалось от 1,4 у популяции заразихи из станицы Привольной до двух у популяции из станицы Крыловской. Эффективное число аллелей составило от 1,14 у популяции заразихи из станицы Привольной до 1,64 у популяции из станицы Крыловской. Наибольшая величина информационного индекса Шеннона, отражающего внутрипопуля-ционное генетическое разнообразие, у крыловской популяции (0,50), наименьшее – в станице Привольной (0,16) (табл. 3). У азовской популяции паразита было самое высокое значение наблюдаемой гетерозиготности Ho (0,11), в то время как у новоаннинской и крыловской оно равня-14

лось 0,00. Значения ожидаемой гетерозиготности He (оценка уровня генетической изменчивости в популяции) колебались от 0,09 у привольненской популяции до 0,34 у кагальницкой. Все образцы заразихи из Испании были гомозиготны и мо-номорфны, следствием чего явились низкие показатели генетической изменчивости. Продемонстрирована их внутри-популяционная однородность (табл. 3). Популяция из Румынии в основном показала меньшее разнообразие, чем российские популяции.

Уровень генетической дифференциации между популяциями количественно оценили с помощью вычисления генетических дистанций Неи (табл. 4). Наименьшее расстояние среди российских популяций обнаружилось между крыловской и новоалександровской (0,126), наибольшее – между азовской и крыловской (0,940). Значительные дистанции от российских показала популяция из Испании – от 0,456 с кагальницкой до 0,970 с при-вольненской. У румынской популяции дистанции с российскими менее значительны – от 0,150 с крыловской до 0,894 с новоаннинской. Также значительна генетическая дистанция между румынской и испанской популяциями заразихи – 0,981.

Таблица 4

Показатели генетического расстояния (под диагональю ) и сходства (над диагональю) между изучаемыми популяциями по микросателлитным маркерам

По-пуля-ция	Pop1	Pop2	Pop3	Pop4	Pop5	Pop6	Pop7	Pop8
Pop1*	-	0,752	0,769	0,634	0,761	0,788	0,773	0,740
Pop2	0,285	-	0,682	0,379	0,676	0,687	0,650	0,530
Pop3	0,263	0,383	-	0,603	0,765	0,882	0,664	0,656
Pop4	0,273	0,392	0,267	-	0,692	0,668	0,391	0,861
Pop5	0,238	0,376	0,126	0,329	-	0,404	0,778	0,558
Pop6	0,257	0,431	0,409	0,407	0,940	-	0,251	0,327
Pop7	0,456	0,970	0,507	0,501	0,720	0,665	-	0,409
Pop8	0,301	0,635	0,421	0,894	0,150	0,584	0,981	-

* Обозначения: Популяции: Pop1 – кагальницкая; Pop2 – привольненская; Pop3 – новоалександровская; Pop4 – новоаннинская; Pop5 – крыловская;

Pop6 – азовская; Pop7 –Кордоба; Pop8 – Калараши

Распределение общей генетической изменчивости между исследованными популяциями и в их пределах изучали методом анализа молекулярной дисперсии (AMOVA). Анализ молекулярной вариан-сы продемонстрировал существенные различия между популяциями и несколько меньшие внутри популяций. Большая часть дисперсии (57 % от общей) была обусловлена различиями между популяциями. Значительная часть дисперсии (38 %) обусловлена различиями внутри популяций. И, наконец, дисперсия между индивидами внутри каждой популяции составила наименьшую величину – 6 % (табл. 5). Таким образом, уровень дифференциации между исследованными популяциями оказался довольно высоким, большая часть выявленного генетического разнообразия приходится на межпопуляционную составляющую.

Таблица 5

Результаты AMOVA анализа общего генетического разнообразия в восьми популяциях O. cumana

Источник разнообразия	Число степеней свободы df	Сумма квадра тов	Доля в общей дисперсии		P*
			абс. значения	%
Между популяциями	7	204,156	1,361	57	<0,001
Внутри популяций	72	140,350	0,903	38
Между индивидуумами	80	11,500	0,144	6
Всего	159	356,006	2,407	100
* Р – вероятность

Вычисление показателей структуры подразделенной популяций (F-статистика Райта) показало высокое значение Fis, отражающего инбридинг особи относительно популяции. Это свидетельствует о том, что в изученных популяциях заразихи наблюдается дефицит (Fis = 0,863) гетерозиготных генотипов, вызванный инбридингом. Также значителен показатель, отражающий инбридинг особи относительно вида в целом: Fit = 0,940. Различия между популяциями (Fst = 0,565; табл. 6) свидетельствуют об их генетической дифференциации.

Значения показателей F-статистики

Райта: Fis, Fit, Fst для восьми популяций

F-статистика	Значение	Вероятность (P)
Fst	0,565	0,001
Fis	0,863	0,001
Fit	0,940	0,001

Таким образом, основные показатели генетического разнообразия, выявленные по десяти микросателлитным локусам, продемонстрировали, что практически во всех популяциях эффективное число аллелей было ниже, чем число аллелей на локус. Наблюдаемая гетерозиготность Ho у всех популяций не превышала ожидаемую. Анализ молекулярной вариансы AMOVA также показал, что дисперсия между индивидами внутри каждой популяции составила всего 6 %. Эти данные свидетельствуют о небольшом уровне внутрипопуляционного полиморфизма как двух иностранных, так и шести российских популяций заразихи. Не обнаружено явной связи между расовым составом и генетическим разнообразием популяций. При этом отмечено, что по показателям % P, I и He среди популяций из России наибольшее генетическое разнообразие показывают кагальницкая и крыловская, в состав которых входит лишь вирулентная раса G. Наименьшими значениями обладает популяция из окрестностей станицы Привольная, в состав которой входит лишь раса Е. В сравнении с популяциями из России, испанская и румынская показали меньшую генетическую изменчивость. Все образцы заразихи из Испании были гомозиготны и мономорфны. Показатели генетического разнообразия популяции из Румынии выше, чем у испанской, но ниже, чем у российских. Полученные данные о крайне низкой внутрипопуляционной изменчивости испанской популяции согласуются с результатами, полученными R. Pineda-Martos с соавторами [3]. В исследовании L. Molinero-Ruiz с соавторами [13], молекулярный анализ методом RAPD среди высоко вирулентных популяций О. cuma- 15

na из Центральной Испании, Венгрии, Южной Испании и Турции выявил внут-рипопуляционную генетическую однородность паразита. Авторы предполагают, что малое генетическое меж- и внутрипо-пуляционное разнообразие испанских популяций заразихи возникло на основе общего их происхождения от ограниченного числа растений-родоначальников (эффект основателя).

Большее генетическое разнообразие российских популяций заразихи, в сравнении с румынскими, было отмечено в исследовании [6], выполненном для O. cumana , паразитирующей на подсолнечнике в России, Румынии и Казахстане, с использованием кодоминантных микросател-литных маркеров. Было высказано предположение, что внутрипопуляцион-ный полиморфизм российских популяций заразихи базируется на генетическом разнообразии сортов подсолнечника, которые возделывались в республиках бывшего СССР. В том же исследовании генетическое расстояние между объединенными пулами – российско-казахским и румынским, составило 0,137. В данной работе дистанции у российских популяций от испанской более значительны – от 0,456 до 0,970. У румынской популяции дистанции от российских менее значительны – от 0,150 до 0,894. G. Gagne с соавторами [2] при использовании RAPD-маркеров для изучения генетической изменчивости у популяций из Болгарии, Турции, Румынии и Испании установили, что испанские популяции были генетически отдалены от других восточноевропейских популяций. Наши исследования также показали значительную дистанцию между румынской (Калараши) и испанской (Кордоба) популяциями заразихи (0,981). В своем исследовании R. Pineda-Martos с соавторами [3] предполагают, что большое генетическое расстояние между популяциями из разных мест, географически отдаленных, может объясняться происхождением семян, интродуцированных из разных областей.

Полученные нами данные о генетических дистанциях свидетельствуют в пользу этой гипотезы.

Проведенные нами исследования выявили, что российские популяции паразита имеют большее генетическое родство по отношению друг к другу (за небольшим исключением) и меньшее – по отношению к иностранным. Это согласуется с данными ряда ученых, установивших, что популяции О. cumana группируются соответственно географического происхождения, независимо от расового состава [2; 3; 6; 13].

Уровень генетической дифференциации между исследованными популяциями, вычисленный при помощи AMOVA и F-статистики Райта, оказался довольно высоким, большая часть выявленного генетического разнообразия приходится на межпопуляционную составляющую. Ранее в нашей работе [7] не было выявлено существенной дифференциации между популяциями заразихи юга России, Казахстана и Румынии, проанализированных с использованием RAPD-локусов. Микросателлитные маркеры позволили с большей точностью дифференцировать генетические пулы заразихи, показав различия между популяциями из Румынии и стран бывшего СССР [6], хотя эти различия были признаны также незначительными. Результаты данной работы показали большую дифференциацию между исследованными восемью популяциями. Это может объясняться несколькими причинами. Во-первых, изучение внутрипопуляционной структуры методом анализа отдельных особей позволяет точнее определить различия внутри и между популяциями. Во-вторых, для анализа был использован другой набор популяций заразихи. Использование в сравнительном исследовании популяции из Испании, наиболее удаленной от российских, увеличило значение показателя генетической дифференциации. Свой вклад внесла и популяция из станицы Привольная. Образец её семян был соб- ран более 10 лет назад, чем семена других популяций, и она отличалась наименьшими вирулентностью и внутрипопуля-ционным генетическим разнообразием. Таким образом, высокий уровень дифференциации может быть обусловлен пространственной и временной изоляцией данных популяций друг от друга. Высокая оценка Fst (0,565) также характерна для видов самоопылителей [2; 14]. И хотя недавнее исследование с использованием гена, который определяет отсутствие антоциановой пигментации, выявило возникновение относительно высокой частоты перекрестного опыления у растений О. cumana (от 14,8 до 40,0 %) [15], основываясь на малом внутрипопуляци-онном генетическом разнообразии [2] и структуре цветка [16] ранее было сделано заключение о преобладании у заразихи процессов самоопыления. Наше исследование подтверждает этот вывод.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что дискриминационный потенциал использованной системы маркеров достаточно информативный для определения меж- и внутрипопуляционной изменчивости заразихи, произрастающей на территории России. В целом популяции характеризуются невысоким уровнем внутрипопуля-ционного генетического разнообразия и высокой степенью межпопуляционной дифференциации. Из российских популяций наибольшую генетическую изменчивость показывают кагальницкая и крыловская, наименьшую – привольнен-ская. Российские популяции отличаются большей внутрипопуляционной изменчивостью, чем испанская и румынская. Генетические дистанции между российскими популяциями в основном меньше, чем их расстояние от испанской и румынской.