Внутрирасовый полиморфизм возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника по SNP-локусам ДНК

Внутрирасовый полиморфизм возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника по SNP-локусам ДНК

Автор: Рамазанова С.А., Антонова Т.С., Ивебор М.В., Стрельников Е.А.

Журнал: Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур @vniimk

Рубрика: Селекция и семеноводство

Статья в выпуске: 1 (150), 2012 года.

Бесплатный доступ

Изучен внутрирасовый полиморфизм 6 SNP-локусов Pfa74, Pfa6, Pha54, Pha56, Pfa82 и Pfa99 у изолятов возбудителя ложной мучнистой росы Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni. 330, 730 и 710 рас. Все изученные изоляты этих рас мономорфны в локусах Pfa74, Pfa6 и Pfa99. Выявлена незначительная аллельная изменчивость по трем локусам Pha54, Pha56 и Pfa82, что составило для расы 330 - 14,7 %, 730 - 31,6, 710 - 8,7 %.

Ложная мучнистая роса подсолнечника, раса, молекулярные маркеры, днк, пцр

Короткий адрес: https://sciup.org/142151054

IDR: 142151054

Текст научной статьи Внутрирасовый полиморфизм возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника по SNP-локусам ДНК

Оомицет Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni – возбудитель одного из наиболее вредоносных заболеваний подсолнечника – ложной мучнистой росы. Самый эффективный метод контроля паразита – введение доминантных генов устойчивости к нему в растение-хозяина. Однако, как показала практика, в популяции P. halstedii происходят постоянные изменения вирулентности возбудителя болезни, что приводит к преодолению им устойчивости. Если впервые о наличии у патогена двух физиологических рас заявили в 70-е годы прошлого столетия [1], в конце 90-х их было выявлено 17 [2], то уже к 2007 г. в мире их идентифицировано не менее 36 [3].

Мониторинг состояния популяции P. halstedii в конкретном регионе позволяет констатировать наличие в нем тех или иных рас, выявлять появление новых. Для этого достаточны классические фитопатологические методы. Однако с их помощью не всегда можно отследить активность эволюционных процессов, происходящих в популяции патогена.

В лаборатории иммунитета и электрофореза ВНИИМК была начата работа по поиску молекулярных маркеров, позволяющих идентифицировать расы P. hals-tedii. Исследования показали, что самыми перспективными для дифференциации рас патогена являются маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен (SNP) [4; 5]. Поэтому целью нашей работы было оценить внутрирасовый полиморфизм SNP-локусов ДНК пригодных для идентификации

Материалы и методы. Материалом для исследований послужили 76 полевых изолятов возбудителя ложной мучнистой росы трех рас 730, 330, 710. Расовую принадлежность изолятов определяли по общепринятой международной методике [6]. Искусственное заражение линий-дифференциаторов подсолнечника осуществляли путем погружения корней проростков в инокулюм зооспор [7].

ДНК выделяли из соскобов кони-диального спороношения P. halstedii и из тканей пораженных семядольных листьев подсолнечника с применением модифицированного СТАВ-метода [8].

Для реакции амплификации были использованы праймеры, фланкирующие участок ДНК с единичной нуклеотидной заменой (SNP-локусы) (табл. 1) [5; 9]. ПЦР выполняли в реакционной смеси (25 мкл) следующего состава: 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мM сульфата аммония; 1,5-3,0 мM MgCl2; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинант- ной термостабильной ДНК-полимеразы («ГосНИИгенетика», Россия). Реакции проводили в амплификаторе «Терцик» («АО ДНК-технология», Россия) при следующих температурных режимах: начальная денатурация при 96° С в течение 4 минут, далее 38 циклов с последовательной сменой температур.

Для выявления мутаций в локусе Pha74 был проведен электрофорез в агарозном геле, а для локусов Pha6, Pha54, Pha56, Pha82 и Pha99 использовали CAPS-анализ, т.е. расщепление амплифициро-ванных фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами) с последующим электрофорезом в агарозном геле. В работе использовали эндонуклеазы рестрикции фирмы Fermentas, представленные в таблице 1. Рестриктную обработку

Таблица 1

Характеристика пар праймеров

Локус Номер в базе данных (Genbank) Нуклеотидная последовательность Эндо-нуклеаза рест-рик-ции Сайт рестрикции Pha74 CB 174642 F:ACCTCGCATG GTTGCTTTAC R:TTGCTATTTCG GCCTACTGG - - Pha6 CB 174585 F:GTCGCTGATTTT ATGTTTATGTGC R:TACTACCTCAGT CACATCATCACC NmuCI (Tsp45I) 5′-GTSAC-3′ Pha54 CB 174708 F:ATTTGGCAACGT CTCAGAGC R:CCATCGTAATAAC ATTCTTTAAAGTCC SmuI (FauI) 5‘-CCCGC(N)4-3‘ Pha56 CB 174714 F:GCGGTACTGG TCTATGTGCTG R:TTCAAGAAGTT TGATTTTTCATGC OliI (AleI) 5′-CACNNNNGTG-3′ Pha82 CB 174573 F:ACTCGATCCAT GCAGTAAGTAAG R:AGGAGGCTT TGCAGATGAA BveI (BspMI) 5′-ACCTGC(N)4-3′ Pha99 CB 174703 F:CTCGCATTCA AACGGAAAAT R:CAAGCCAAC TGTGCAATGAAT BseMI (Bsr DI) 5′-GCAATGNN-3′ продуктов амплификации в количестве 10 мкл проводили в буферных растворах и согласно инструкциям, прилагаемым фирмой производителем к каждой эндонуклеазе рестрикции. Время инкубации для всех рестриктаз – 3 ч при температуре

37 °С. Электрофорез продуктов рестрикции проводили в 2 %-ном агарозном геле на основе ТАЕ буфера при напряжении 90100 V и силе тока 50 А, в течение 1,5 ч. Гели окрашивали бромистым этидием. Визуализацию проводили с использованием гель-документирующей системы BioPrint.

Результаты и обсуждение. Среди изученных полевых изолятов P. halstedii большее их количество (34) принадлежало расе 330, которая является одной из наиболее распространенных на Юге Российской Федерации [10]. Изоляты этой расы были собраны на полях ВНИИМК и в разных районах Краснодарского края и Ростовской области. Также были использованы два изолята из Испании и США, любезно предоставленные нам французскими коллегами (INRA, UMR santé Vegtale INRA-ENITA). Проведенный CAPS-анализ показал незначительную внутри-расовую изменчивость. По локусам Pha74, Pha6 и Pha99 не выявлено внутрирасовой изменчивости (табл. 2). По локусу Pha54 отличились два образца – № 2, собранный с поля ВНИИМК, и № 33 из Испании. В отличие от остальных образцов, у них обнаружен аллель 2. Это значит, что в последовательности ДНК данного локуса у этих изолятов в сайте рестрикции обнаружена мутация (замена одного нуклеотида).

По локусу Fha82 выделился изолят под номером 15. Здесь, наоборот, изменения в сайте рестрикции приводят к тому, что рестриктаза «не узнает» последовательности, и разрезание не происходит.

Были выявлены также два изолята – № 13 и № 17, отличающиеся по локусу Pha56. У образца № 6 обнаружены оба аллеля (табл. 2). Наличие в образце ДНК обоих аллелей, скорее всего, связано с тем, что здесь, по-видимому, присутствует смесь рас. В целом, из 34 изолятов расы 330, выявлено лишь 5, отличающихся аллельным состоянием трёх SNP-локусов от остальных. Возможно, что отличающиеся изоляты имеют другую расовую принадлежность, либо это редкие единичные мутации, которые периодически возникают и исчезают в популяциях.

Аллельное состояние изолятов расы 330 по SNP-локусам ДНК

Таблица 2

№ п/п

Хозяин

Место сбора изолята*

Локус

Pha74

Pha6

Pha54

Pha82

Pha56

Pha99

1

Неизвестный

Поля ВНИИМК

2

2

1

2

2

1

2

Неизвестный

-//-

2

2

2

2

2

1

3

PR64A83

Выселковский р-н

2

2

1

2

2

1

4

Родник

Каневской р-н

2

2

1

2

2

1

5

Мастер

-//-

2

2

1

2

2

1

6

Смесь с разных хозяев

-

2

2

1

2

1,2

1

7

Флагман

-//-

2

2

1

2

2

1

8

Мастер

-//-

2

2

1

2

2

1

9

ВК680

Поля ВНИИМК

2

2

1

2

2

1

10

Неизвестный

-//-

2

2

1

2

2

1

11

Родник

Каневской р-н

2

2

1

2

2

1

12

Арена

-//-

2

2

1

2

2

1

13

ВК678

Поля ВНИИМК

2

2

1

2

1

1

14

ВК678

-//-

2

2

1

2

2

1

15

СПК

Крыловской р-н

2

2

1

1

2

1

16

СПК

-//-

2

2

1

2

2

1

17

Неизвестный

Поля ВНИИМК

2

2

1

2

1

1

18

ВК680

-//-

2

2

1

2

2

1

19

Родник

-//-

2

2

1

2

2

1

20

Флагман

Каневской р-н

2

2

1

2

2

1

21

Родник

Поля ВНИИМК

2

2

1

2

2

1

22

Родник

-//-

2

2

1

2

2

1

23

Арена

Каневской р-н

2

2

1

2

2

1

24

Донской крупноплодный

Куйбышевский р-н Ростовской области

2

2

1

2

2

1

25

Донской крупноплодный

-//-

2

2

1

2

2

1

26

ВК680

Поля ВНИИМК

2

2

1

2

2

1

27

Родник

-//-

2

2

1

2

2

1

28

ВК653

Кавказский р-н

2

2

1

2

2

1

29

Мастер

Каневской р-н

2

2

1

2

2

1

30

Мастер

-//-

2

2

1

2

2

1

31

Арена

-//-

2

2

1

2

2

1

32

Неизвестный

Поля ВНИИМК

2

2

1

2

2

1

33

Неизвестный

Испания

2

2

2

2

2

1

34

Неизвестный

США

2

2

1

2

2

1

*Все изоляты собраны в Краснодарском крае за исключением № 24, № 33, № 34

Аналогично, по SNP-локусам были изучены 19 изолятов расы 730. Для изо-лятов этой расы, также не было обнаружено полиморфизма по трем локусам Pha74, Pha6 и Pha99. По локусу Pha54 были выделены образцы, отличающиеся аллельным состоянием от большинства. Это четыре изолята из Краснодарского края и один французский; у них обнаружен аллель 2, тогда как у остальных присутствует аллель 1 (табл. 3). Следует отметить, что из четырех отличившихся образцов, три были собраны в Выселков-ском районе на поле с распространенностью болезни порядка 40 %. При этом раса 730 была доминирующей в этом агроценозе, в отличие от большинства других исследованных в Краснодарском крае: почти повсеместно преобладала раса 330. Изолят № 7 с этого же поля отличался по локусу Pha56 (табл. 3).

Таблица 3

Аллельное состояние изолятов расы 730 по SNP-локусам ДНК

№ п/п

Хозяин

Место сбора изолята*

Локус

Pha 74

Pha

6

Pha 54

Pha 82

Pha 56

Pha 99

1

Родник

Высел-ковский р-н

2

2

1

2

2

1

2

ВК678

Поля ВНИИМК

2

2

1

2

2

1

3

Родник

Высел-ковский р-н

2

2

1

2

2

1

4

Родник

-//-

2

2

2

2

2

1

5

Родник

-//-

2

2

1

2

2

1

6

Родник

-//-

2

2

2

2

2

1

7

Родник

-//-

2

2

1

2

1

1

8

Родник

-//-

2

2

2

2

2

1

9

ВК678

Поля ВНИИМК

2

2

1

2

2

1

10

Круиз

-//-

2

2

1

2

2

1

11

Круиз

-//-

2

2

1

2

2

1

12

Круиз

-//-

2

2

1

2

2

1

13

Круиз

-//-

2

2

1

2

2

1

14

Неизвестный

-//-

2

2

2

2

2

1

15

680хМастер

-//-

2

2

1

2

2

1

16

Флагман

Каневской р-н

2

2

1

2

2

1

17

РМ 17

Лабинский р-н

2

2

1

2

2

1

18

Родник

Поля ВНИИМК

2

2

1

2

2

1

19

Неизвестный

Франция

2

2

2

2

2

1

*Все изоляты собраны в Краснодарском крае за исключением № 19

Изоляты расы 710 оказались почти все одинаковы по аллельному состоянию SNP-локусов. Только один изолят под номером 18, собранный в Тбилисском районе с неизвестного генотипа подсолнечника, отличался от остальных по локусу Pha54. Возможно, этот образец представляет собой расу 730, ошибочно определённую как раса 710. А по локусу Pha82 у изолята № 9 обнаружено два аллеля; возможно, он представляет собой смесь рас.

Таблица 4

Аллельное состояние изолятов расы 710 по SNP-локусам ДНК

№ п/п

Хозяин

Место сбора изолята*

Локус

Pha 74

Pha 6

Pha 54

Pha 82

Pha 56

Pha 99

1

PR64A83

Высел-ковский р-н

2

2

2

2

2

1

2

Неизвестный

Каневской р-н

2

2

2

2

2

1

3

Родник

Высел-ковский р-н

2

2

2

2

2

1

4

Неизвестный

Поля ВНИИМК

2

2

2

2

2

1

5

Родник

Высел-ковский р-н

2

2

2

2

2

1

6

Круиз

Поля ВНИИМК

2

2

2

2

2

1

7

Круиз

-//-

2

2

2

2

2

1

8

Круиз

-//-

2

2

2

2

2

1

9

Круиз

-//-

2

2

2

1,2

2

1

10

Круиз

-//-

2

2

2

2

2

1

11

Круиз

-//-

2

2

2

2

2

1

12

Родник

Высел-ковский р-н

2

2

2

2

2

1

13

Неизвестный

Поля ВНИИМК

2

2

2

2

2

1

14

Родник

Высел-ковский р-н

2

2

2

2

2

1

15

Родник

-//-

2

2

2

2

2

1

16

Родник

-//-

2

2

2

2

2

1

17

Родник

-//-

2

2

2

2

2

1

18

Неизвестный

Кавказский рн

2

2

1

2

2

1

19

Родник

Поля ВНИИМК

2

2

2

2

2

1

20

Родник

Выселковский р-н

2

2

2

2

2

1

21

Неизвестный

Поля ВНИИМК

2

2

2

2

2

1

22

Неизвестный

-//-

2

2

2

2

2

1

23

Неизвестный

Франция

2

2

2

2

2

1

*Все изоляты собраны в Краснодарском крае за исключением № 23

Как видно из результатов исследования, среди изолятов всех изученных рас выявлена некоторая неоднородность. В процентном соотношении внутрирасовый полиморфизм шести SNP-локусов составил: у расы 330 – 14,7 %, 730 – 31,6 %, 710 – 8,7 %. Возможно, эта неоднородность связана с неточностью определения расовой принадлежности отличившихся изолятов P. halstedii с помощью стандартного набора линий-дифференциаторов подсолнечника. Для более четкой идентификации этот набор необходимо дополнить другими линиями-дифференциаторами. Проблема в настоящее время активно обсуждается исследователями из разных стран, занимающимися изучением данного патогена.

Как оказалось, наибольший внутрирас-овый полиморфизм выявлен у расы 730. Каждый из ее изолятов был повторно испытан на соответствующих линиях-дифференциаторах подсолнечника, с целью исключения возможного смешения в одном образце рас 330 и 710. Поэтому встречаемость у образцов ДНК расы 730 аллелей, свойственных как расе 330, так и расе 710, мы рассматриваем как свидетельство в пользу высказанного ранее [11] предположения, что биотип 730 является гибридом этих двух рас.

Таким образом, изученные изоляты рас P. halstedii 330 и 710 показали высокую степень однородности в 6 SNP-локусах ДНК. Незначительная изменчивость в трёх локусах Pha54, Pha56 и Pha82 может быть связана с погрешностями в определении рас с помощью стандартного набора линий-дифференциаторов подсолнечника. Изменчивость расы 730 в локусе Pha54 более значительная. Она имеет аллели, свойственные как расе 330, так и расе 710. Это может свидетельствовать о её происхождении от гибридизации этих двух рас.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант №11-04-96501

Статья научная
QR-код для установки приложения SciUp Наведите камеру и скачайте бесплатное приложение SciUp