Воспроизводительные качества петухов с нормальным и модифицированным геномом

Целенаправленная модификация генома сельскохозяйственной птицы — перспективное направление современной биотехнологии, которое рассматривается как альтернатива традиционной селекции (1). Этот подход позволяет значительно ускорить получение популяций особей с желаемыми, а также качественно новыми признаками, привнесение которых стандартными селекционными методами невозможно. Однако приемы, используемые для изменения генома у трансгенных сельскохозяйственных животных, малоэффективны при создании генно-модифицированной птицы, что связано с особенностями ее воспроизводства и развития (2). В то же время биология этой таксономической группы дает возможность существенно расширить набор методов для эффективного введения рекомбинантной ДНК в клетки-мишени. Эмбрионы птиц развиваются вне организма самки, что облегчает доступ к ним при выполнении

^∗ Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ ¹ 16-16-10059 (исследование петухов, полученных посредством трансплантации донорских сперматогониев) и в рамках задания Федерального агентства научных организаций (ФАНО России) ¹ АААА-А18-118021590132-9 (исследование трансгенных петухов, полученных с использованием лентивирусных векторов).

генно-инженерных манипуляций. В качестве перспективных мишеней для введения рекомбинантной ДНК рассматриваются клетки бластодермы (3, 4), примордиальные зародышевые клетки (5, 6) и сперматогонии (7).

В настоящее время разработаны методы для эффективного направленного переноса рекомбинантных генов в эмбриональные и соматические клетки кур, в частности введение рекомбинантной ДНК в эмбриональные клетки с помощью лентивирусных (8) и ретровирусных (9) векторов, трансплантация трансформированных донорских примордиальных зародышевых клеток (10, 11) и сперматогониев (12, 13), трансформация примордиальных зародышевых клеток (14) и сперматогониев (15) in vivo. С использованием этих подходов выведены трансгеные куры, продуцирующие с белком яйца маркерные белки (16, 17) и рекомбинантные белки человека (18, 19). Однако при дальнейшем разведении таких особей возможны проблемы с получением трансгенного потомства (репродуктивные нарушения, меньшая численность и низкая жизнеспособность), обусловленные низкой фертильностью исходных родительских форм. В ряде исследований показано снижение оплодотворяющей способности семени и либидо у самцов трансгенных животных по сравнению с нетрансгенными особями (20, 21). На трансгенной сельскохозяйственной птице подобные исследования практически не проводились. В этой связи представляет интерес изучить воздействие трансгенеза на функциональное состояние половых клеток генетически модифицированной птицы, в частности петухов.

В настоящем исследовании впервые изучена гистологическая структура семенников и состав сперматогенных клеток в семенных канальцах у трансгенных петухов, полученных с использованием разных методических подходов. Установлено снижение качества и оплодотворяющей способности семени у трансгенных петухов по сравнению с контролем. Впервые выявлено уменьшение числа сперматогенных клеток в семенных канальцах петухов после трансплантации донорских сперматогониев. При этом не обнаружено значительных патологических нарушений в гистологической структуре семенников.

Цель работы заключалась в оценке репродуктивных качеств трансгенных петухов в сравнении с их нетрансгенными аналогами, а именно в изучении качественных и количественных показателей семени, его оплодотворяющей способности, гистоструктуры семенных канальцев семенников и количественного состава в них сперматогенных клеток.

Методика . Исследования выполняли на трансгенных петухах ( Gallus gallus L.), полученных на основе породы Первомайская. В I группу ( n = 4) входило потомство, выведенное из эмбрионов, в которые in vivo вводили лентивирусный вектор pWRSV, полученный нами ранее; II группу ( n = 5) составили стерильные петухи-реципиенты после трансплантации в их семенники трансформированных in vitro донорских сперматогониев. Контрольная группа ( n = 5) включала нетрансгенных особей в возрасте 8-9 мес, подобранных по принципу аналогов. Трансгенная и нетрансгенная птица содержалась в условиях физиологического двора (ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста, 2018 год) в индивидуальных клетках. При кормлении использовали полнорационные комбикорма.

Сперму от петухов получали посредством абдоминального массажа 1 раз в 2-3 сут. Для выработки условного рефлекса спермоотдачи петухов подготавливали в течение 1-2 нед. Объем эякулята определяли градуированной пипеткой (до 1,0 мл). Концентрацию сперматозоидов рассчитывали с использованием камеры Горяева при просмотре под микроскопом Nikon Ni-U («Nikon Corporation», Япония; увеличение ½400). Их подвиж- ность оценивали на нагревательном столике при 38-40 °С, эякулят предварительно разбавляли 5-кратно. Свежеполученные препараты сперматозоидов фиксировали в метаноле в течение 10 мин и проводили морфометрический анализ (увеличение ½400) с помощью цифровой камеры Nikon DS-Qi2 («Nikon Corporation», Япония; разрешение 4908½3264 px). Морфометрические показатели (площадь головки и акросомы, общая длина сперматозоида, длина жгутика) рассчитывали с использованием встроенного программного обеспечения NIS-Elements BR 4.30 («Nikon Corporation», Япония). У каждого петуха просматривали не менее 100 сперматозоидов. Состояние акросом изучали на фиксированных препаратах сперматозоидов с помощью набора для дифференциального окрашивания Диахим-Дифф-Квик (НПФ «Абрис+», Россия).

Критериями оценки оплодотворяющей способности семени служили оплодотворяемость яиц и вывод молодняка.

Гистологические препараты семенников готовили по общепринятой методике (22). Образцы ткани фиксировали в растворе Буэна (пикриновая кислота:уксусная кислота:формалин в соотношении 15:1:5) в течение 48 ч. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Для анализа отбирали только семенные канальцы, имеющие просвет и округлую форму (поперечный срез). Клетки сперматогенного ряда идентифицировали по морфологии (23). От каждого самца исследовали не менее 30 семенных канальцев. Изображения обрабатывали и анализировали с помощью пакета программ NIS-Elements («Nikon Corporation», Япония). Определяли диаметр семенных канальцев, количество сперматогенных клеток в них, клеточный состав популяции.

Полученные данные обрабатывали статистически в программе Microsoft Excel. В таблицах представлены средние арифметические значения ( M ) и ошибки средних ( ± SEM). Достоверность различий оценивали по t -критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты . Визуальная оценка образцов семени, полученных от трансгенных петухов и самцов контрольной группы, не выявила каких-либо значительных отклонений: цвет и запах эякулятов соответствовали установленным требованиям. Однако по показателям качества семени между экспериментальными группами имелись различия (табл. 1).

1. Показатели качества семени у трансгенных и нетрансгенных петухов ( Gallus gallus L.) породы Первомайская ( M± SEM, физиологический двор ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста, 2018 год)

Показатель	Группа
	контроль	I	II
Объем эякулята, мл	0,31±0,11	0,25±0,09	0,19±0,08
Концентрация сперматозоидов, млрд/мл	2,98±0,76	2,51±0,65	2,11±0,74
Подвижность сперматозоидов, %	86±6	85±7	84±8
Доля сперматозоидов с аномальной морфологией, %	9±3	12±4	11±3

П р и м еч а ни е. Описание групп см. в разделе «Методика».

У трансгенных петухов наблюдалась тенденция к снижению объема эякулята и концентрации сперматозоидов по сравнению с контролем: в I группе — соответственно на 19 и 15 %, во II группе — 38 и 29 %. Кроме того, у трансгенных петухов сперматозоиды были менее подвижными, однако в этом случае различия оказались менее существенными и не превышали 2 %.

Наряду с уменьшением объема эякулята и концентрации сперматозоидов в опытных группах возрастала доля сперматозоидов с аномальной морфологией. Различия с контролем по этому показателю составили 33 % в I группе и 22 % — во II группе. Анализ процентного соотношения сперматозоидов с анормальной морфологией разных участков (головка, средняя часть и жгутик) показал, что наиболее частыми были нарушения в области жгутика (рис.). В контрольной группе этот показатель составил 4 %, в опытных — 5 %. По сравнению с ним доля сперматозоидов с анормальной морфологией головки и средней части во всех эксперимен- тальных группах была ниже на 1-2 %.

Доля сперматозоидов с анормальной морфологией головки (а) , средней части (б) и жгутика (в) в эякулятах у трансгенных и нетрансгенных петухов ( Gallus gallus L.) породы Первомайская: К — контроль, I и II — опытные группы (физиологический двор ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста, 2018 год). Описание групп см. в разделе «Методика».

Мы также установили различия между экспериментальными группами по морфометрическим показателям сперматозоидов (табл. 2). У трансгенных петухов из I группы наблюдалось увеличение площади головки на 27 % по сравнению с контролем (р < 0,01), из II группы — на 6 %. Кроме того, несколько уменьшалась длина жгутика и, как следствие, общая длина сперма- тозоидов (до 2 %). Размеры акросом у трансгенных особей в I группе уменьшались по сравнению с контролем на 33 %, во II группе — на 25 %

(р < 0,05). Следует, однако, отметить, что эти морфометрические измене- ния не оказывали значительного влияния на сохранность акросом: у всех петухов она была практически одинаковой и составила у трансгенных — 98,9 %, у нетрансгенной — 99,0 %.

2. Морфометрические показатели сперматозоидов в эякулятах у трансгенных и нетрансгенных петухов ( Gallus gallus L.) породы Первомайская ( M± SEM, физиологический двор ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста, 2018 год)

Группа	Площадь, мкм2		Длина, мкм
	головка	акросома	общая	жгутик
Контроль	11,9±0,6	1,2±0,1	81±3	68±3
I	15,2±0,7**	0,8±0,1*	79±1	67±2
II	12,7±0,5	0,9±0,1*	80±1	66±3

П р и м е ч а н и е. Описание групп см. в разделе «Методика».

*, ** Различия с контролем статистически значимы соответственно при р ≤ 0,05 и р ≤ 0,01.

Оплодотворяющая способность семени от трансгенных петухов была ниже по сравнению с контролем (табл. 3). В I опытной группе процент оплодотворенных яиц и полученных цыплят был соответственно на 4 и 15 % ниже аналогичных показателей, установленных для контрольной птицы. Во II опытной группе различия составили 6 и 10 % (р < 0,05).

3. Развитие эмбрионов и результативность получения цыплят от трансгенных и нетрансгенных петухов ( Gallus gallus L.) породы Первомайская ( M± SEM, физиологический двор ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста, 2018 год)

Группа	Заложено яиц на инкубацию, шт.	Из них, шт. (%)		Развилось эмбрионов, %	Получено цыплят, %
		не оплодотворено	оплодотворено
Контроль	50	3 (6)	47 (94)	90	85
I	50	5 (10)	45 (90)	84	70
II	55	7 (12)	48 (88)*	85	75

П р и м е ч а н и е. Описание групп см. в разделе «Методика». * Различия с контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

Сходные данные получены для трансгенных сельскохозяйственных животных, в частности коз и кроликов. У козлов с геном лактоферрина человека hLF описано снижение качества семени и его оплодотворяю- щей способности (различия до 13 % по сравнению с контрольной группой) (20, 24). У самцов кроликов с геном гормона роста быка bGH наблюдалось снижение либидо (21). В то же время у мышей, трансгенных по гену лактоферрина человека, репродуктивные показатели были в норме (25). У овец, несущих в геноме рекомбинантный ген химозина крупного рогатого скота, процент объягнившихся маток также соответствовал нормативным показателям (26).

Снижение воспроизводительных качеств у трансгенных петухов по сравнению с контролем было обусловлено ухудшением ряда показателей качества семени, в частности уменьшением объема эякулята, подвижности и концентрации спермиев (см. табл. 1). Снижение концентрации спермиев в эякулятах, полученных от трансгенных петухов, подтвердили гистологические исследования. Анализ гистоструктуры семенных канальцев выявил снижение числа сперматогенных клеток в семенных канальцах у трансгенных петухов по сравнению с контролем (табл. 4). Наиболее выраженные изменения относительно контроля по этому показателю отмечались у трансгенных петухов после трансплантации донорских спер-матогониев (II группа) — на 19 %. При этом у трансгенных петухов, полученных с использованием лентивирусного вектора (I группа), разница с контролем по числу сперматогенных клеток не превышала 2,5 %.

4. Содержание разных типов сперматогенных клеток в семенном канальце (шт.) у трансгенных и нетрансгенных петухов ( Gallus gallus L.) породы Первомайская ( M± SEM, физиологический двор ФНЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста, 2018 год)

Группа	Всего	Клетки Сертоли	Сперматого-нии	Сперматоциты 1-го и 2-го порядка	Сперматиды	Спермии
Контроль	1198±115	18±3	69±5	613±20	218±14	280±17
I	1167±213	15±2	65±8	625±35	205±18	257±25
II	960±88	17±3	58±11	526±31	158±25	201±14*

П р и м еч а ни е. Описание групп см. в разделе «Методика».

* Различия с контролем статистически значимы при р ≤ 0,05.

Сравнительный анализ качества семени трансгенных петухов, полученных с помощью разных методических подходов, продемонстрировал, что трансгенные петухи из I группы превосходили трансгенных особей из II группы (в частности, по объему эякулята семени и концентрации спер-миев соответственно на 24 и 16 %). Оплодотворяющая способность семени у петухов, полученных с использованием лентивирусного вектора, также была выше аналогичного показателя у особей после трансплантации трансформированных донорских сперматогониев.

Таким образом, проведенные исследования показали, что интеграция трансгена сказывается на функциональном состоянии половых клеток у генетически модифицированных петухов: наблюдается снижение объема эякулята, концентрации и подвижности сперматозоидов, уменьшается количество сперматогенных клеток в семенных канальцах, ухудшается оплодотворяющая способность семени. В то же время отклонений в сохранности акросом у трансгенной птицы мы не обнаружили. Анализ семенников у трансгенных петухов и их нетрансгенных аналогов также не выявил значительных патологических нарушений в гистоструктуре.