Возможность использования вторичного сырья в качестве питательной среды для синтеза эргостерола дрожжами вида Saccharomyces cerevisiae

Эргостерол (эргостерин) (эргоста-5,7,22-триен-3β-ол, рис. 1) является предшественником витамина D2, а также необходим для синтеза гормонов кортизона и флавона.

Из-за наличия асимметричного центра в молекуле эргостерола его химический синтез сложен, многостадиен и требует высоких материальных, энерго- и трудозатрат [6, 13, 19, 21]. Вследствие чего процессы дрожжевого биосинтеза стали наиболее привлекательными методами получения эргостерина в промышленных масштабах. Среди всего разнообразия потенциальных продуцентов эргостерола предпочтение отдается различным штаммам

Saccharomyces cerevisiae , как достаточно неприхотливым и наиболее изученным микроорганизмам.

Биосинтез эргостерола дрожжами в последние годы являлся предметом многочисленных исследований и на сегодняшний день достаточно полно представлен в литературе (рис. 2).

Эргостерол является основным липидным компонентом мембраны клеток дрожжей и определяет их структурные особенности, такие как проницаемость, текучесть и целостность, которые важны для правильного функционирования мембранных белков. Эргостерол обеспечивает барьерную функцию мем-

браны и деятельность ассоциированных с мембраной ферментов. Значительная нехватка эргостерина или его разрушение приводят к дестабилизации мембраны [1, 2, 7, 11, 14, 19]. На эргостерин приходится более 60 % от всех стеринов дрожжевой клетки, его содержание в среднем составляет 0,2 - 0,5 % сухой биомассы дрожжей, для некоторых штаммов может достигать 10 %.

Исследования последних лет указывают на то, что синтез эргостерина протекает в строго аэробных условиях. Так, Alexandra Cristina Blaga и соавторы установлено, что для образования одной молекулы эргостерина необходимо десять молекул кислорода [13].

Помимо аэрации к процессу дрожжевого биосинтеза эргостерола предъявляются и другие требования, в частности исследованиями X. He и соавторами установлено, что на эффективность биосинтеза оказывает влияние соотношение источников углерода и азота в питательной среде, а также накопленный в процессе брожения этанол [14].

Tianwei Tan и соавторы проводили исследования, направленные на выявление взаимосвязи процесса накопления биомассы дрожжей и синтезом эргостерола, которые показали, что для синтеза эргостерола прирост биомассы не является тригерным фактором. Наиболее активно синтез эргостерола протекал в зрелой культуре дрожжей [22].

Вместе с тем, несмотря на то, что производство эргостерола путем дрожжевого биосинтеза представляет собой активно эксплуатируемую отрасль биотехнологий, многие аспекты этого процесса до сих пор остаются неизученными [3–5, 8–10, 12, 15]. В частности, в литературе отсутствуют системные данные о возможности регулирования интенсивности биосинтеза эргостерола путем изме- нения содержания сухих веществ в питательной среде. Кроме того, значительный практический интерес представляет возможность использования отходов пищевых производств в качестве основы для питательной среды в технологии дрожжевого биосинтеза. В рамках данных исследований изучалась возможность использования отходов производства сока из сортов яблок, районированных в Уральском регионе.

Целью настоящего исследования стало изучение интенсивности накопления эргостерола дрожжами при использовании питательных сред на основе экстрактов яблочного жмыха с различным содержанием глюкозы.

Объекты и методы исследований

Для исследования было выбрано 2 образца дрожжей Saccharomyces cerevisiae :

образец 1 – дрожжи сухие хлебопекарные производства АО Компания «ПРОКСИМА»;

образец 2 – дрожжи сухие быстродействующие «Dr. Oetker» производства ЗАО «Д-р Оеткер».

Внешний вид дрожжей в сухом виде и результаты их микроскопии представлены на рис. 3.

В качестве питательной среды использовалась стерильная среда YP (8×2 % пептона, 8×2 % дрожжевого экстракта) с дополнительно внесенным количеством глюкозы в количестве 1, 8 и 15 %.

Дрожжи вносили в предварительно ре-гидратированном виде в количестве 3 об. % к объему питательной среды.

Таким образом, был сформирован перечень объектов исследования, представленный в таблице.

Процесс брожения протекал при температуре 37 °С в течение 48 часов в аэробных условиях. Содержание эргостерина оценивали через каждые 12 часов.

SQUALENE

SQUALENE EPOXIDE

LANOSTEROL

4.4-DIMETHYLCHOLESTA-8.14.24 TRIENOL

4.4-DIMETHYLZYMOSTEROL

Предварительно была проведена условная оценка степени зрелости дрожжевой культуры путем микроскопирования окрашенного раствором Люголя препарата дрожжей.

Характеристика объектов исследования

Код образца	Используемые дрожжи	Содержание глюкозы в питательной среде, %
1.1	образец 1	1
1.2	образец 1	8
1.3	образец 1	15
2.1	образец 2	1
2.2	образец 2	8
2.3	образец 2	15

ERG 24.26.27

4a - METHYLZYMOSTEROL

ERG 24.26.27

ZYMOSTEROL

ERG 6

FECOSTEROL

EPISTEROL

ERG3

ERGOSTA 5.7.24 (28) TRIENOL

ERG 5

ERGOSTA 5.7.22.24 (28) TETRAENOL

ERGOSTEROL

Рис. 2. Метаболический путь синтеза эргостерола Saccharomyces cerevisiae [13]

Содержание эргостерина в дрожжах определяли спектрофотометрически. Для чего из навески 200 мг дрожжей экстрагировали эргостерин с использованием 70 % раствора этилового спирта. Определение оптической плотности вещества проводили в концентрированной серной кислоте при длине волны СФ 328 нм.

Содержание эргостерола определяли по формуле

A ×100×25×100

Acm×m×(100-W) ,

где A – оптическая плотность испытуемого раствора; m – точная навеска анализируемого образца, мл; W – влажность сырья; Acm – удельный показатель поглощения чистого эргостерина.

Результаты и обсуждение

Для эффективного протекания процессов биосинтеза к состоянию дрожжевой культуры предъявляется ряд требований, в том числе контролируется количество почкующихся клеток, мертвых клеток, наличие посторонних микроорганизмов, содержание в дрожжах запасных питательных веществ (гликогена и волютина) [7, 15–17, 21].

Поскольку исследования, представленные в литературе, указывают на то, что для эффективного синтеза эргостерола необходима зрелая культура дрожжей, то в рамках проводимых исследований на первом этапе была проведена оценка физиологического состоя-

б)

а)

в)                                                                   г)

Рис. 3. Внешний вид исследуемых дрожжей Saccharomyces cerevisiae: а – образец 1, сухие дрожжи; б – образец 1, препарат «раздавленная капля» при увеличении ×600; в – образец 2, сухие дрожжи; г – образец 2, препарат «раздавленная капля» при увеличении ×600

ние дрожжевых культур путем микроскопирования окрашенного раствором Люголя препарата (рис. 4) [4, 7, 13, 15, 18].

Известно, что количество гликогена в клетках дрожжей меняется как от их возраста, так и в зависимости от условий культивирования. В зрелых клетках гликоген занимает от 1/3 до 2/3 клетки и более. В клетках с низкой физиологической активностью окрашенный гликоген занимает менее 1/4 клетки. В молодых клетках гликоген отсутствует и при окрашивании раствором йода клетки приобретают бледно-желтый цвет [2, 6–8, 12, 19, 20].

Результаты микроскопии показали, что исходное состояние дрожжевых суспензий было близким. Исследуемые дрожжи имели овальную форму, клетки дрожжей образца 1 отличались несколько меньшими размерами, чем клетки образца 2. Окраска суспензий дрожжей йодсодержащим раствором показала, что в суспензии дрожжей образца 1 превалировали дрожжи зрелые (окрашенные в коричневый цвет), клетки дрожжей образца 2

можно было отнести к молодым (отмечалось преимущество клеток со светло-желтой окраской).

Результаты определения эргостерола в исследуемых образцах дрожжей представлены на рис. 5.

Полученные результаты показали, что исследуемые образцы дрожжей способны синтезировать эргостерол в количествах, достигающих 5,4–5,8 % от количества биомассы. При этом наблюдается выраженная зависимость накопленного эргостерола от используемой питательной среды. Так, для обоих образцов дрожжей использование питательной среды, содержащей 1 % глюкозы, оказалось неэффективным. За период 48 часов биосинтез эргостерола не превышал 2,5 и 2,0 % для образцов 1 и 2 соответственно.

Наиболее интенсивно синтез эргостерина протекал при содержании глюкозы 8 и 15 % не зависимо от образцов дрожжей. При этом характер синтеза был схож. Так, при использовании питательной среды с содержанием

а)                                                          б)

Рис. 4. Результаты микроскопии дрожжей (препарат «раздавленная капля», окрашенный раствором Люголя, увеличение × 600): а – образец 1; б – образец 2

а)

—о— 2.1         2.2   ••*••2.3

б)

Рис. 5. Количество эргостерола, синтезированное в процессе брожения исследуемыми образцами дрожжей, %: а – образец 1; б – образец 2

глюкозы 8 % наибольшая интенсивность накопления эргостерола отмечалась в период с 12 до 36 часов как для образца 1, так и для образца 2, что вероятно соответствовало середине экспоненциальной фазы роста дрожжей. Достаточно большое количество глюкозы (8 и 15 %) в питательных средах позволило обеспечить относительно высокую скорость синтеза эргостерола для обоих образцов дрожжей. Вместе с тем, при использовании среды с содержанием глюкозы 8 % активный синтез эргостерола начинается уже после 12 часов брожения, тогда как при содержании глюкозы 15 % – только после 24 часов. Очевидно, высокая концентрация глюкозы (15 %) привела к снижению доступного кислорода для дрожжей и быстрому росту клеток в период с 12 до 24 часов, что привело к сдвигу фазы активного синтеза эргостерола. На конец брожения, через 48 часов, количество накопленного эргостерола в образцах дрожжей, брожение которых протекало в среде с содержанием глюкозы 8 и 15 % различалось незначительно, колебания составили 0,2–0,3 %.

Заключение

Таким образом, представленные материалы свидетельствуют о том, что процесс интенсивности биосинтеза эргостерола дрожжами можно регулировать путем изменения содержания глюкозы, как основного источника углерода, в питательной среде. Установлено, что нехватка глюкозы приводит к снижению общей эффективности синтеза эргостерола, тогда как ее избыток – к сдвигу фазы активного синтеза эргостерола и увеличению продолжительности этого процесса во времени. Настраивая процесс биосинтеза эргостерола путем оптимизации состава питательной среды и других характеристик можно эффективно решать биотехнологические задачи в промышленных масштабах.

Статья выполнена при поддержке Правительства РФ (Постановление № 211 от 16.03.2013 г.), соглашение № 02.A03.21.0011.