Встречаемость ретровирусов животных в районах Республики Татарстан

В экономике Республики Татарстан одной из доминирующих отраслей является сельское хозяйство, в частности животноводство. Скотоводство Татарстана показывает довольно высокие результаты по производству мяса и молока в сравнении с другими регионами Российской Федерации. Заболевания, вызываемые ретровирусами, причиняют животноводству существенный экономический ущерб, который выражается в недополучении молока и приплода, преждевременной выбраковке животных, нарушении воспроизводительной функции больных животных, ограничениях племенной работы и хозяйственной деятельности в связи с неблагополучием [6].

Ретровирусы – это РНК-содержащие вирусы, встраивающие свой геном в геном клетки организма хозяина. Семейство ретровирусов включает такие заболевания животных как вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (КРС), вирус лейкоза крупного рогатого скота, вирус артрита-энцефалита коз, вирус висна-маеди овец, инфекционную анемию лошадей и другие [15]. Для репликации своего генома ретровирусы используют механизм обратной транскрипции для синтеза копий ДНК (провирусная ДНК). Как правило, ретровирусы инфицируют соматические клетки. Однако некоторые из них в результате инфекции могут попадать в клетки зародышевого пути. В этом случае интегрированные вирусные гены наследуются по тем же законам, что и остальные гены организма [13].

Лейкоз крупного рогатого скота – хроническое заболевание опухолевой природы, проявляющееся лимфоцитозом и опухолегенезом, ведущее животное к гибели. Этиологическим агентом заболевания является вирус бычьего лейкоза – Bovine Leukemia Virus, согласно Международной таксономии, относящийся к роду Deltaretroviridae [10]. Болеет преимущественно взрослый крупный рогатый скот. При этом заболевании возможно длительное вирусоносительство и инфицирование молодых особей перед проявлением клинических признаков. Это связано с тем, что вирусная частица в организме животного в течение короткого времени преобразуется в ДНК-провирус, не проявляясь клиническими симптомами [9]. Есть сообщения о межвидовой передаче данного вируса [3, 8]. В соответствии с Ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с лейкозом КРС, утвержденными приказом Минсельхоза РФ в 2021 году, молоко и молозиво от инфицированного животного, предварительно подвергая термической обработке путем прогревания при температуре не ниже 85 °С в течение не менее 10 минут или кипячения не менее 5 минут разрешено сдавать на переработку или использовать внутри резервации, притом молоко от больных животных подлежит уничтожению. Убой больных и инфицированных животных осуществляется на предприятиях по убою животных или оборудованных для этих целей убойных пунктах. При обнаружении у животных клинической стадии болезни при патологоанатомическом вскрытии, их мясо подлежит утилизации [2]. Диагностику вируса лейкоза проводят серологическими (реакциями иммунодиффузии в геле, иммуноферментный анализ) и молекулярно-генетическими

(полимеразная цепная реакция) методами. Серологические методы диагностики не позволяют точно выявлять активные антитела, возникающие при вирусном инфицировании, примерно до шестимесячного возраста теленка, так как в данный период жизни в их крови присутствуют материнские антитела, обеспечивающие колостральный иммунитет. Однако метод полимеразной цепной реакции позволяет прямо осуществлять детекцию вируса путем обнаружения минимального количества копий провирусной ДНК в образцах в течение латентного периода болезни, а у телят – старше 15-дневного возраста [1, 4].

Вирус артрита-энцефалита коз (ВАЭК) относится к лентивирусам подсемейству ретровирусов, куда входят также антигенно и генетически родственные вирусы висна-маеди овец, инфекционной анемии лошадей, иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ2). Это медленно протекающая вирусная болезнь, сопровождающаяся развитием энцефаломиелитов (преимущественно у молодняка), хронических пролиферативных синовитов, периартритов, прогрессирующих интерстициальных пневмоний и интралобулярных маститов [11]. Имеются данные об образовании антител к антигенам данного вируса у людей. Но особую актуальность придает факт того, что у людей, употребляющих молоко от инфицированных ВАЭК коз, наблюдается неспецифическое (положительное)

реагирование в серологических реакциях на ВИЧ-1 и ВИЧ-2 [14].

Ретровирус     часть     времени находится в организме не в виде вирусной частицы, а в виде провируса, не проявляя клинической картины заболевания. Таким образом, вирусная частица находится в крови в момент заражения (кратковременно) и во время активной репродукции вируса, соответственно РНК вируса можно выявить только в это время. Провирусная ДНК представлена в геноме самого зараженного организма, и в достаточном количестве присутствует в крови. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет проводить индикацию вируса в самые ранние сроки, после попадания вируса в организм [12].

Цель данного исследования – мониторинг животноводческих хозяйств Республики Татарстан на наличие ретровирусов, а именно возбудителя лейкоза КРС (ВЛ КРС) и вируса артрита-энцефалита коз (ВАЭК).

Материал и методы исследований.

Нами были отобраны образцы крови крупного рогатого скота и коз из различных животноводческих хозяйств РТ. Отбор проб осуществляли в вакуумные пробирки с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) из яремной вены. Всего было происследовано 144 образца крови КРС из 3 районов РТ (Лаишевского, Буинского и Алькеевского) по 48 проб, а также 108 образцов крови коз из 3 козоводческих хозяйств РТ, из каждого хозяйства по 36 образцов крови.

Нуклеиновые кислоты выделяли комплектами реагентов «МАГНО-сорб» (для ВАЭК) и «ДНК-сорб-В» (для ВЛ КРС) согласно инструкции производителя. Для ПЦР амплификации использовалась плазмидная ДНК положительного контроля. ПЦР осуществляли на амплификаторе C1000 с оптическим блоком CFX96 («BioRad», США).

Методика проведения ПЦР амплификации аналогична описанной ранее [5] со следующими модификациями: для возбудителя лейкоза КРС – прямой праймер tgttcaatgtttctcaaggcaacgc; обратный праймер aggtgagtctctgatggctaagggc; зонд ROX-cctcctatctccctggttaatctctctacggc – RTQ, температура отжига составляла 60,5 °C, считывание результатов ПЦР (флуоресценции) происходило в каждом цикле ПЦР, при 60,5 °C по каналам Rox и Cy5;  для ВАЭК – прямой праймер gcaaacgcgattcagcagtct; обратный праймер taccatggcataggttgcctctaa;     зонд     Rox- ctgtccagacccttgctaatgcaactgc-BHQ2, температура отжига праймеров составляла 57° C, детекция результата ПЦР (флуоресценции) происходит на каждом цикле ПЦР, при 57 °C по каналам Rox и Cy5. Для более детального исследования данных образцов был проведен ИФА на обнаружение противолейкозных антител к антигену gp 51 (ген env) «Набором ИФА (Вариант 2) VeriTest» (ООО «Ветбиохим», Россия),     согласно     приложенной инструкции. Для подтверждения наличия антител к антигену р 28 возбудителя висна-маеди/артрита-энцефалита коз применяли иммуноферментный анализ (коммерческий тест IDEXX, Франция), который основан на использовании иммуногенного пептида трансмембранного белка (TM, ген env) и рекомбинантного белка p 28, входящего в состав капсида вируса (ген  gag),  в соответствии       с       инструкцией производителя.

Результат исследований В результате исследования, проведенного в животноводческих хозяйствах районов РТ, методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, с использованием специфичных праймеров на ВЛ КРС и иммуноферментного анализа с антигеном gp 51 были получены следующие результаты. Методом ПЦР выявлено 39 положительных образцов (27 %) и 105 отрицательных (73 %). Методом ИФА в 30 образцах были обнаружены антитела к вирусу лейкоза КРС, 114 образцов были определены как серонегативные. В Лаишевском районе методом ПЦР выявлено положительных на вирус лейкоза 21 животных, тогда как в ИФА – 18. В Буинском районе выявлено 12 положительных проб, здесь же методом ИФА выявлено лишь 6 положительных проб. И 6 положительных проб были одинаково обнаружены методами ПЦР и ИФА в Алькеевском районе (Таблица 1).

Таблица 1 – Результаты исследования по обнаружению ВЛ КРС

Таблица 2 – Результаты исследования по обнаружению ВАЭК

Данные, полученные в результате ПЦР и иммуноферментного анализа на ВАЭК показывают, что вирус артрита-энцефалита коз обнаружился в хозяйствах Высокогорского (18 проб) и Черемшанского районов (6 проб), в хозяйстве Верхнеуслонского района данный вирус не выявлен. Всего положительных проб на ВАЭК по исследуемым хозяйствам 24, из которых

ПЦР показало 24 положительных результата, а ИФА только 18, в 6 пробах антитела против ВАЭК не обнаружились (Таблица 2).

Кроме того, в ходе данной работы проведена диагностика на клинические признаки ВАЭК. У некоторых коз из хозяйства Высокогорского района выражен артрит суставов, шаткость походки, в других исследуемых хозяйствах клинические признаки ВАЭК не обнаружены. Важная роль в распространении ретровирусных инфекций принадлежит импорту животных [7]. Несмотря на отсутствие специфических клинических признаков, у некоторых инфицированных вирусом животных наблюдается снижение общей резистентности организма. Частота развития патологий коррелирует с увеличением возраста животных. Ретровирусные инфекции имеют во многом схожий цикл репродукции вируса, и проявление одного ретровируса в организме животных становится подобным, как и у других представителей семейства Retroviridae. Этот факт необходимо учитывать при разработке методологии диагностики ретровирусных болезней.

Заключение. По лейкозу КРС исследовано 144 пробы крови КРС из разных животноводческих районов РТ методами ПЦР и ИФА. Методом ПЦР обнаружено 39 положительных образцов, ИФА – 30 образцов. По нашим данным, высокая инфицированность наблюдалась в Лаишевском районе (21 положительных образцов из 48) и низкая - в Алькеевском районе (6 из 48). Несовпадение результатов ПЦР и ИФА могут говорить об особенностях вирусного цикла вируса лейкоза, а также о высокой чувствительности метода ПЦР. То есть, провирус лейкоза КРС можно обнаружить на ранних стадиях инфицирования, когда в организме животного антитела к нему еще не образованы. По вирусу артрита-энцефалита коз всего проанализировано 108 образцов, положительных проб по исследуемым хозяйствам 24, из которых ПЦР показало 24 положительных результата, а ИФА только 18; в 6 пробах антитела против ВАЭК не обнаружились. Это связано с особенностями процесса инфицирования ВАЭК, провирус может быть обнаружен на ранних стадиях, а антитела образуются на более поздней стадии после заражения животного и могут длительное время циркулировать в организме инфицированных животных. Расхождение результатов ПЦР и ИФА связано с особенностями вирусного цикла ретровирусов, а также более высокой чувствительностью метода ПЦР по сравнению с ИФА. Важно отметить, что наиболее достоверным и точным диагностическим решением является комплексная диагностика ретровирусов животных, которая включала бы применение всех методов обнаружения данного заболевания, описанных нами ранее в статье. Это обеспечило бы наиболее достоверную развернутую клиникодиагностическую картину для ветеринарного врача или исследователя, а значит, послужило бы более эффективными мерами профилактически-оздоровительных мероприятий при борьбе с ретровирусами сельскохозяйственных животных.