Выбор источника фукоидана и оптимизация его ферментативного гидролиза
Автор: Новикова Ю.С., Анохина Е.П., Корнеева О.С.
Журнал: Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий @vestnik-vsuet
Рубрика: Биотехнология, бионанотехнология и технология сахаристых продуктов
Статья в выпуске: 2 (64), 2015 года.
Бесплатный доступ
Разработка биотехнологии фукозы и фукоолигосахаридов из растительного сырья вызывает особый интерес, что обусловлено широким спектром биологических активностей фукозы. Фукоза является незаменимым углеводным компонентом иммуноглобулинов и выполняет важные биологические функции в процессах онтогенеза, клеточной дифференциации и формирования иммунитета, а также в репродуктивных процессах позвоночных. Фукоза и ее полимеры обладают пребиотическим действием, а фукоолигосахариды проявляют также антиоксидантную активность. Одним из перспективных способов получения фукозы и фукоолигосахаридов является ферментативный гидролиз фукоиданов растительного сырья. Наиболее доступным и недорогим растительным сырьем для выделения фукоидана являются бурые водоросли. Литературный анализ показал, что водоросли Fucus vesiculosis характеризуются наибольшим содержанием фукоидана, который по химической структуре является гомополимером фукозы с преобладанием 1,3 - гликозидных связей. Был исследован гидролиз фукоидана водорослей Fucus vesiculosis иммобилизованным ферментным препаратом α-L-фукозидазы для определения оптимальных условий проведения ферментативного процесса. Эффективность ферментативной деструкции фукоидана зависит от ряда факторов, важными из которых являются дозировка ферментного препарата, рН реакционной среды и температура, при которых протекает процесс гидролиза, а также его продолжительность. В результате проведенных исследований установлены оптимальные параметры процесса ферментативного гидролиза фукоидана водорослей Fucus vesiculosis : дозировка ферментного препарата 6 ед/г, температура 50 ºС, рН 7,0, продолжительность процесса 5 ч. При таких условиях степень гидролиза фукоидана составляла 83-85%, что показывает перспективность ферментативного гидролиза для получения фукозы из растительного сырья.
Фукоидан, бурые водоросли, α-l-фукозидаза, фукоза, фукоолигосахариды, гидролиз, субстрат
Короткий адрес: https://sciup.org/14040421
IDR: 14040421
Текст научной статьи Выбор источника фукоидана и оптимизация его ферментативного гидролиза
Актуальной в настоящее время является разработка биотехнологий продуктов функционального назначения. Особый интерес привлекает «минорный» сахар – фукоза, который является незаменимым углеводным компонен- том иммуноглобулинов и других биологически активных веществ [1].
Фукоза выполняет важные биологические функции в процессах онтогенеза, клеточной дифференциации, а также установлена важная роль
фукозы в формировании иммунитета [2, 3] и в репродуктивных процессах позвоночных [4]. Фукоза и ее полимеры обладают пребиотическим действием [5], а фукоолигосахариды проявляют также антиоксидантную активность [6].
В чистом виде фукоза практически не встречается в природе, а входит в состав фукоиданов - полисахаридов бурых водорослей, некоторых морских беспозвоночных и бактерий.
Одним из перспективных способов получения фукозы и фукоолигосахаридов является биодеструкция фукоиданов бурых водорослей.
Ранее получен иммобилизованный ферментный препарат α-L-фукозидазы [7], способный расщеплять гликозидные связи в фукоиданах, использование которого позволит повысить рентабельность получения фукозы и фукоолигосахаридов из растительного сырья.
Цель данного исследования состояла в подборе перспективного источника фукоидана среди бурых водорослей и определении оптимальных условий ферментативного гидролиза фукоидана.
Объектами исследования служили иммобилизованная α-L-фукозидаза с каталитической активностью 2310 ед./г и фукоидан бурых водорослей.
Выделение фукоидана из бурых водорослей проводили по методу, позволяющему разделять водорастворимые полисахариды водорослей [8].
Определение оптимальных условий ферментативного гидролиза субстрата проводили в интервале рН 6,0–8,0, температур 30–70 °С и при разной дозировке ферментного препарата.
Для определения степени гидролиза фукоидана 1 мл 10 % водного раствора фукоидана, 1 мл 0,1 М фосфатного буфера и 100 мкл раствора фермента выдерживали при заданной температуре в течение 6 часов. Затем определяли количество фукозы по методу Дише [9]. По количеству образовавшейся фукозы в результате гидролиза рассчитывали степень гидролиза фукоидана.
Наиболее доступным и недорогим растительным сырьем для выделения фукоидана являются бурые водоросли.
Фукоидан бурых водорослей представляет собой сложный сульфатированный полисахарид, основным звеном которого является L-фукоза [10]. Химическая структура фукоидана бурых водорослей представлена на рисунке 1.
Фукоиданы разных видов водорослей различаются по молекулярной массе (от 10 до
1000 кДа), моносахаридному составу (помимо фукозы в состав могут входить галактоза, манноза, ксилоза, арабиноза, рамноза, рибоза), степени сульфатирования молекул фукозы и типу связи между ними [11].
Me
4-сульфат
O SO
OSO -
(1 ^ 4)-связь
Me
- O SO

(1 ^ 3)-связь
OSO -
O

2-сульфат
2,3-разветвление
з,4-разветвление
Рисунок 1. Химическое строение фукоидана бурых водорослей
Содержание фукоидана в бурых водорослях варьирует от 0,6 до 7,9 % на сухое вещество. Наибольшее количество фукоидана содержат водоросли порядков Laminariales и Fucales , сравнительный химический состав которых представлен в таблице 1. Как видно из таблицы, наибольшее содержание фукоидана отмечено в водорослях Fucus vesiculosis .
Фукоидан водоросли Fucus vesiculosis является частично сульфатированным гомополимером фукозы с преобладанием 1,3 – гликозидных связей, что облегчает очистку фукозосодержащих гидролизатов из-за отсутствия в продуктах гидролиза других сахаров [10].
Проведенный анализ содержания фукоиданов в бурых водорослях и их структуры показал, что наилучшим источником фукоидана являются водоросли Fucus vesiculosis . Кроме того эти водоросли являются дешевым и доступным сырьем в Северном и Дальневосточном регионах России.
На фукоидане, выделенном из водорослей Fucus vesiculosis, исследовали действие иммобилизованной α-L-фукозидазы в процессе гидролиза.
Эффективность ферментативного гидролиза зависит от ряда факторов, важными из которых являются дозировка ферментного препарата, температура и рН реакционной среды, при которых протекает гидролиз, а также время гидролиза.
Т а б л и ц а 1
Химический состав бурых водорослей порядков Laminariales и Fucales , % на сухую массу [12]
Водоросли |
Минеральные вещества |
Белок |
Йод |
Маннит |
Альгиновая кислота |
Фукоидан |
Липиды |
Порядок Laminariales - ламинариевые |
|||||||
Laminaria japonica |
20,7 |
9,7 |
0,22 |
12,8 |
26,3 |
2,54 |
2,10 |
L. bongardiana |
10,5 |
8,3 |
0,12 |
15,3 |
34,1 |
3,6 |
0,88 |
L. cichorioides |
19,4 |
3,6 |
0,21 |
9,4 |
15,7 |
2,88 |
0,64 |
L. gurjanovae |
14,4 |
2,9 |
0,25 |
9,7 |
21,3 |
3,8 |
1,29 |
Kjellmanella crassifolia |
26,6 |
10,4 |
0,11 |
12,3 |
27,7 |
3,32 |
0,98 |
Agarum cribrosum |
23,1 |
16,8 |
0,04 |
4,3 |
23,5 |
2,1 |
0,56 |
Alaria fistulosa |
24,9 |
10,4 |
0,07 |
8,5 |
24,4 |
0,70 |
1,40 |
A. angustata |
25,4 |
11,7 |
0,14 |
6,4 |
30,5 |
2,10 |
1,40 |
Порядок Fucales - фукусовые |
|||||||
Fucus evanescens |
18,6 |
10,0 |
0,007 |
5,5 |
36,4 |
6,04 |
1,12 |
Cystoseira crassipes |
12,9 |
10,9 |
0,002 |
5,6 |
34,6 |
5,4 |
0,6 |
Fucus vesiculosis |
17,9 |
9,4 |
0,006 |
5,4 |
34,9 |
7,2 |
1,15 |
Sargassum pallidum |
10,7 |
5,6 |
0,011 |
10,3 |
26,7 |
4,0 |
0,82 |
На рисунке 2 представлена зависимость степени гидролиза фукоидана от дозировки ферментного препарата. Фермент вносили в количестве 1-10 ед./г фукоидана. Внесение фермента в количестве 1 ед./г обеспечивало степень гидролиза менее чем на 30 % за 5 ч. При увеличении концентрации ферментного препарата до 4 ед./г степень гидролиза за то же время составила около 60 %. Максимальный выход фукозы 85 % обеспечивало внесение фермента в количестве 6 ед./г фукоидана. Повышение концентрации фермента до 10 ед./г не способствовало значительному увеличению степени гидролиза. Следовательно, оптимальной дозировкой фермента следует считать дозировку 6 ед./г фукоидана.

-■- 2 ед/г
-*- 4 ед/г
6 ед/г
-♦- 8 ед/г
-•- 10 ед/г
Продолжительность гидролиза, ч
Рисунок 2. Влияние дозировки ферментного препарата на степень гидролиза фукоидана
1 ед/г
Далее исследовали влияние температуры на степень гидролиза фукоидана в интервале 30-70 °С при дозировке 6 ед./г и рН 7,0. Данные таблицы 2 показывают, что максимальная степень гидролиза 84 % наблюдалась при температуре 50 оС. Дальнейшее увеличение температуры приводило к снижению степени гидролиза, что обусловлено термической инактивацией фермента.
Т а б л и ц а 2
Степень гидролиза фукоидана при разных температурах (СГ, %)
Температура ºС |
Степень гидролиза (СГ), % при продолжительности гидролиза, ч |
|||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
30 |
16 |
29 |
42 |
55 |
60 |
61 |
40 |
14 |
34 |
47 |
62 |
77 |
78 |
50 |
18 |
36 |
58 |
66 |
84 |
86 |
60 |
13 |
29 |
48 |
55 |
60 |
64 |
70 |
9 |
22 |
27 |
34 |
48 |
51 |
Влияние рН реакционной среды на эффективность гидролиза фукоидана изучали при дозировке фермента 6 ед/г и температуре 50 оС. Из таблицы 3 видно, что рН среды оказывает сильное влияние на действие фермента. Максимальная степень гидролиза фукоидана наблюдалась при рН 7,0. Смещение рН среды в кислую или щелочную область приводило к значительному снижению выхода фукозы. В щелочной среде, например, при рН 8,0 за 5 часов гидролиза выход фукозы составил около 30 %, а при рН 7,0 за то же время - 84%.
Рациональным временем гидролиза следует считать 5 часов, при которых степень гидролиза достигает 84 %, Дальнейшее увеличение продолжительности гидролиза не приводит к значительному увеличению выхода фукозы.
Т а б л и ц а 3
Степень гидролиза фукоидана в зависимости от рН среды (СГ, %)
рН |
Степень гидролиза (СГ), % при продолжительности гидролиза, ч |
|||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
6,0 |
13 |
25 |
40 |
44 |
48 |
50 |
6,5 |
17 |
34 |
58 |
62 |
79 |
79 |
7,0 |
18 |
35 |
59 |
66 |
84 |
85 |
7,5 |
11 |
16 |
26 |
39 |
52 |
53 |
8,0 |
7 |
13 |
19 |
24 |
30 |
31 |
Список литературы Выбор источника фукоидана и оптимизация его ферментативного гидролиза
- Ройт, А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. 592 с.
- Luther K.B., Haltiwanger R.S. Role of unusual O-glycans in intercellular signaling//The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2009. V. 41. P. 1011-1024.
- Becker D. J., Lowe J. B. Fucose: biosynthesis and biological function in mammals//Glycobiology. 2003. V. 13. P. 41-53.
- Intra J., Cenni F., Perotti M.-E. An α-L-fucosidase potentially involved in fertilization is present on drosophila spermatozoa surface//Molecular reproduction and development. 2006. V. 73. P. 1149-1158.
- Санина Т.В. и др. Исследование бифидогенной активности фукозы и ее полимеров//Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2011. № 1. С. 141-143.
- Черенков Д.А., Анохина Е.П., Кирьянова С.В., Корнеева О.С. Антиоксидантная активность продуктов гидролиза природных полимеров (маннана и фукоидана)//Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2012. №1. С. 151-153.
- Мещерякова О.Л., Новикова Ю.С., Анохина Е.П., Корнеева О.С. Получение и характеристика биокатализаторов на основе иммобилизованных гликозидаз//Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2014. №4. С. 206-212.
- Пат. № 2003123744, RU МПК A61K35/80, A61K31/715. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением препаратов для медицины и косметологии/Шевченко Н.М., Имбс Т.И., Урванцева А.М., Кусайкин М.И., Корниенко В.Г., Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. № 2003123744/15; Заявл. 28.07.2003; Опубл. 27.01.2005, Бюлл. № 3.
- Dische Z., Shettles L. B. A specific color reaction of methylpentoses and a spectrophotometric micromethod for their determination//J. Biol. Chem. 1948. V. 175. № 2. P. 595-603.
- Усов А.И., Кирьянов А.В. Полисахариды водорослей. Выделение фракций фукоидана из бурых водорослей//Биоорганическая химия. 1998. № 24. С. 437-445.
- Кузнецова Т. В. и др. Сравнительное исследование биологической активности фукоиданов из бурых водорослей//Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2006. № 6. С. 105-110.
- Аминина Н. М. и др. Состав и возможности использования бурых водорослей дальневосточных морей//Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2007. № 7. С. 123-130.