Выбор криопротекторов для замораживания бактериального концентрата симбиотической закваски

Введение. При производстве бактериальных концентратов важнейшей задачей является сохранение качественных показателей в течение длительного времени. Наиболее распространенным способом консервирования бактериальных концентратов является замораживание и лиофилизация [4, 6, 9, 12]. Для защиты микроорганизмов от криоповреждений применяют защитные среды [6, 9]. Растворы «истинных» криопротекторов при замораживании способствуют формированию так называемого стекловидного льда, в то время как соединения, неспособные к протекторному эффекту, образуют гексагональные кристаллы [6, 10]. Скорость образования льда, как известно, во многом зависит от способности того или иного вещества образовывать водородные связи - чем выше это свойство, тем быстрее снижается скорость роста кристаллов льда. Соединения, обладающие способностью образовывать большое количество водородных связей с жидкой фазой, проявляют защитные свойства. Такое свойство этих соединений способствует уменьшению количества способной к кристаллизации воды в клетке и изменению характера самой кристаллизации. Защитные вещества, связывающие водород до определенной степени, могут стабилизировать поверхностную гидратацию клетки за счет упрочнения гидратационных решеток, окружающих клетки, что уменьшает возможность их повреждения при замораживании [8, 9]. Эффективный криопротектор должен быть нетоксичным, при этом он должен поддерживать в растворенном состоянии соли и белки вплоть до эвтектического перехода в аморфное состояние, то есть его растворы должны иметь низкую эвтектическую температуру, чтобы сократить температурный интервал воздействия твердой фазы на структуру вещества в процессе замораживания и отогрева. Для низкотемпературной консервации бактерий чаще всего используют глицерин в концентрациях 5-25 % в составе водных растворов, жидких питательных сред, в сочетании с другими криозащитными веществами [1]. Лучшей средой для консервации бактерий, имеющих медицинское значение, по сообщению R.K.A. Feltham с соавторами, является бульон Oxoid с 10 % глицерина. Выживаемость бактерий составляет 67–100 % [1, 11].

Из углеводов для хранения бактерий при низких температурах используют глюкозу, сахарозу, лактозу, трегалозу в концентрациях 5-15 %. Считается, что углеводы обладают менее выраженными криозащитными свойствами, чем глицерин, поэтому их рекомендуют применять в сочетании с другими протекторами. Однако было установлено, что протекторное действие сахарозы сопоставимо с глицерином для криоконсервации P. putida , E. coli и B. Thuringiensis [1]. Сахара, проникая в клетку и создавая там осмотическое давление, препятствуют образованию кристаллов льда и разрушению клетки в процессе замораживания [1, 5].

Среды, в которых в качестве коллоида вводится желатин и агар-агар, нашли широкое применение при производстве сухих живых вакцин, так как они лишены антигенных свойств. Наиболее часто применяемая доза желатина в защитных средах составляет 1-2 % [6, 7, 12]. Желатин увеличивает стабилизирующее действие среды и позволяет хранить высушенные культуры без создания вакуума, не проникает в клетку, но заставляет клеточную оболочку плотнее прилегать к цитоплазме, что важно при размораживании [5, 7].

Цель исследования : изучение влияния кри-протекторов различного состава на сохранение микрофлоры бактериального концентрата симбиотической закваски при замораживании.

В связи с поставленной целью в работе решались следующие задачи :

• -    выбор вида и дозы криопротектора для замораживания симбиотического бактериального концентрата;

• -    оценка уровня выживаемости жизнеспособных клеток;

  – исследование ферментативной активности замороженного бактериального концентрата.

Объект и методы исследования . Объектом исследования были крипротекторы глицерин, сахароза, желатин; бактериальный концентрат симбиотической курунговой закваски [2, 3].

Использовали стандартные и общепринятые методы исследования. Титруемая кислотность – по ГОСТ 3624 титрованием 0,1 н. раствором едкого натра с фенолфталеином, выражается в градусах Тернера. Величина активной кислотности - по ГОСТ Р 53359-2009 потенциометрическим методом на приборе Анион-7000.

Исследовали влияние криопротекторов на сохранение жизнеспособности микроорганизмов бактериального концентрата симбиотической закваски замораживанием в морозильной камере до -25 °С со скоростью охлаждения 100 °С в минуту. В качестве базовой смеси использовали свежую питательную среду с буферными солями. Выживаемость клеток после замораживания оценивали по количеству жизнеспособных бакте- рий относительно количества микроорганизмов в бактериальном концентрате до замораживания. Количество микроорганизмов оценивали методом предельных разведений на среде MRS культивированием: термофильные лактобактерии – при 42 °С; мезофильные лактобактерии - при 30 °С.

Для определения количества жизнеспособных клеток дрожжей использовали следующие среды:

• -    дрожжи, сбраживающие лактозу, на картофельно-лактозной среде культивированием при 30 ° С;

• -    дрожжи, не сбраживающие лактозу, на картофельно-глюкозной среде культивированием при 30 ° С.

Результаты исследования и их обсуждение. При замораживании большое внимание уделяется составу защитных сред, обеспечивающих внутри- и внеклеточную защиту при замораживании. В качестве криопротекторов были использованы следующие вещества: глицерин, сахароза, желатин, – широко применяемые для консервирования микроорганизмов и обеспечивающие их высокую выживаемость [1, 4, 5, 7, 11]. В таблице 1 представлены характеристики образцов, использованных для исследования.

Таблица 1

Номер образца	Количество криопротектора, %
	Глицерин	Желатин	Сахароза
1	2	–	–
2	5
3	7
4		2
5		5
6		7
7			2
8			5
9			7

Содержание криопротекторов в защитной среде

Для выбора криопротекторов одинаковое количество бактериального концентрата симбиотической закваски вносили в стеклянные флаконы, в которые затем вносили криопротекторы в разных концентрациях. Замораживание проводили при -25 °С со скоростью охлаждения 100 °С. После 24-часовой выдержки при -25 °С флаконы размораживали в водяной бане при 37-40 °С. Из размороженных заквасок делали посевы методом предельного разведения в питательные среды для количественного учета термофильных, мезофильных лактобактерий, дрожжей, сбраживающих и не сбраживающих лактозу. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Выживаемость клеток после замораживания

Номер образца	Количество микроорганизмов симбиотической закваски, КОЕ/см3
	Лактобактерии		Дрожжи
	термофильные	мезофильные	сбраживающие лактозу	не сбраживающие лактозу
Бакконцентрат до замораживания	8·1011	6·1010	7·109	9·1010
1	4·1010	7·109	2·108	4·108
2	2·1011	5·1010	1·109	5·1010
3	3·109	3·109	5·108	2·108
4	4·1011	1·1010	1·108	3·109
5	5·1011	5·1010	3·109	3·1010
6	3·1011	3·1010	5·109	5·1010
7	7·108	3·107	5·103	1·104
8	3·1010	8·109	4·105	2·106
9	2·1011	5·1010	3·108	6·109

Из таблицы 2 видно, что присутствие 5 % глицерина и более 5 % желатина в защитной среде благотворно влияет на выживаемость дрожжей, наиболее уязвимых к замораживанию, и молочнокислых бактерий. Кроме этого, в указанных образцах сохраняется исходное количественное соотношение основных групп микроорганизмов симбиотической закваски.

Для оценки ферментативной активности образцов 2 и 5 проводили культивирование на пасте- ризованном охлажденном до 30 °С обезжиренном молоке. Для сквашивания вносили 1 ед. закваски (из расчета 25 мл на 100 кг молока). В качестве контроля использовали кисломолочный продукт курунга, полученный сквашиванием обезжиренного молока жидкой пересадочной закваской. Результаты оценки качественных показателей образцов представлены в таблице 3.

Таблица 3

Показатель	Контроль	Образец 2	Образец 5
Органолептические показатели	Вкус кисломолочный, с дрожжевым привкусом, консистенция жидкая, хлопьевидная, слегка газированная
Активная кислотность, рН	3,6 + 0,1	3,6	3,6
Титруемая кислотность, ° Т	200–220	202	204
Продолжительность, ч	14–15	12	14
Количество жизнеспособных микроорганизмов, КОЕ/см3:
термофильные лактобактерии	106	108	108
мезофильные лактобактерии	109	109	109
дрожжи, сбраживающие лактозу	107	105	104
дрожжи, не сбраживающие лактозу	105	105	105

Качественная оценка ферментативной активности образцов

Из таблицы 3 видно, что наибольшей ферментативной активностью обладает образец, где в качестве криопротектора использовали глицерин. Вероятно, это связано с тем, что глицерин обладает смешанным эффектом действия – эндо-экстрацеллюлярным [6]. Применение замороженного концентрата на 2 часа ускоряет продолжительность сквашивания молока до рН 3,6 в сравнении с контролем.

Выводы . Установлено, что защитная среда, содержащая 5 % глицерина, обеспечивает высокий уровень выживаемости микроорганизмов закваски при замораживании и обеспечивает сохранение исходного количественного соотношения основных групп микроорганизмов бактериального концентрата.

Ферментативная активность бактериального концентрата, замороженного в защитной среде с 5 % глицерина, превосходит пересадочную жидкую курунговую закваску на 2–3 ч.