Выделение и описание штаммов Bacillus cereus как факторов риска пищевых отравлений пиццей с говядиной (Ханой, Вьетнам)

По разным оценкам, бактерия B. cereus считается причиной почти 12 % инцидентов пищевых отравлений во всем мире. Согласно данным Центра по контролю и предотвращению заболеваний (CDC) в США, бактерии вида Bacillus spp вызвали 619 вспышек пищевых отравлений с общим количествам случаев заболеваний 7385, из них 75 случаев тяжелого заболевания и трех смертей, за период с 1998 по 2015 г. [1]. В Китае за период с 2010 по 2020 г. было зарегистрировано 419 вспышек пищевых отравлений, вызванных B. cereus, с общим количеством пострадавших 7892 человека, из которых 2786 человек были госпитализированы, а пять случаев закончились смертельным исходом [2]. Во Вьетнаме также были зарегистрированы многочис- ленные вспышки отравлений с участием B. cereus. Например, в 2020 г. 230 человек отравились едой, загрязненной бактериями Escherichia coli (E. coli), Staphylococcus aureus (S. aureus) и B. cereus, в одном из вегетарианских ресторанов в Да Нанге. В том же году десятки детей дошкольного возраста были госпитализированы в Кан Тхо после употребления в пищу супа пхо и йогурта, обсемененных B. cereus. В 2022 г. более 600 студентов в Нха Транг были госпитализированы после употребления в пищу жареных куриных крылышек, загрязненных Salmonella, B. cereus и E. coli, и один исход был фатальным.

Бактерия B. cereus – это грамположительная палочковидная бактерия семейства Bacillaceae и

Нгуен Тханх Трунг – кандидат наук, руководитель лаборатории микробиологии продуктов питания (e-mail: ; тел.: + 84349363269; ORCID: .

Пхам Нгок Ха – магистр, научный сотрудник лаборатории микробиологии продуктов питания (e-mail: ; тел.: + 84963991575 ; ORCID: .

Нинх Тхи Нанх – научный сотрудник лаборатории микробиологии продуктов питания (e-mail: ; тел.: + 84338273077; ORCID: .

одна из самых распространенных причин пищевых отравлений. Бактерия B. cereus повсеместно обнаруживается в почве, воде и пищевых продуктах, в особенности рисе, готовых продуктах и молочных продуктах¹. Следует заметить, что бактерия B. cereus устойчива к нагреванию, а ее споры обладают высокой лекарственной устойчивостью, что позволяет данному штамму выживать в разных условиях окружающей среды. Бактерия B. cereus способна вырабатывать токсины и вызывает два вида последствий пищевых отравлений, сопровождающихся преимущественно рвотой (токсины обычно возникают уже при потреблении загрязненных пищевых продуктов) и / или диареей (токсины продуцируются бактерией после того, как загрязненный продукт попадает в ЖКТ) [3].

Широкое применение антибиотиков привело к возникновению лекарственной устойчивости у многих штаммов бактерий, включая B. cereus , которая часто продуцирует ферменты β-лактамазы, обеспечивающие сильную устойчивость к β-лактамным антибиотикам [4]. Согласно рекомендациям Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), штаммы B. cereus в основном восприимчивы к аминогликозидам, клиндамицину, хлорамфениколу, эритромицину и ванкомицину. Однако в нескольких исследованиях отмечается, что бактерия B. cereus обладает устойчивостью к тетрациклину, стрептомицину, ципрофлоксацину, клоксациллину, эритромицину и рифампицину [5].

Отравления, сопровождающиеся преимущественно диареей, связаны с негемолитическим энтеротоксином ( nhe ), гемолизином BL ( hbl ), цитотоксином K ( cytK ) и энтеротоксином T ( bceT )² [6–8]. Однако данные об энтеротоксическом потенциале bceT , приведенные в нескольких исследованиях, остаются противоречивыми [9, 10]. Отравления, сопровождающиеся преимущественно рвотой, связаны с геном рвотного токсина NRPS (нерибосомная пептидная синтетаза) бактерии B. cereus и продукцией таких токсичных пептидов, как Cereulide и isocereulides A-G. Этот ген функционирует независимо от конвенционального синтеза белков и позволяет бактерии эффективно синтезировать опасные вещества, повышающие вирулентность B. cereus при вспышках пищевых отравлений [11].

В Ханое, где при приготовлении пищи применяются в основном традиционные способы, необходим постоянный мониторинг и описание штаммов B. cereus, связанных со вспышками пищевых отравлений, для определения их происхождения, понима- ния их эпидемиологических характеристик и разработки эффективных профилактических мер.

Цель исследования – построение профиля лекарственной устойчивости и определение генов вирулентности штаммов бактерии B. cereus , обусловивших в 2024 г. в Ханое вспышки пищевой этиологии в двух детских садах при употреблении пиццы с говядиной.

Материалы и методы. В качестве причины отравления дошкольников в двух детских садах (условно А и В) были определены 10 штаммов бактерии B. cereus , выделенных из образцов пиццы с говядиной. Оба дошкольных учреждения расположены в г. Ханое и находятся под единым управлением. Случаи отравления зарегистрированы в 2024 г. В учреждении А пострадали 135 детей дошкольного возраста, у которых были диагностированы желудочно-кишечные расстройства. В учреждении В было зарегистрировано 77 детей дошкольного возраста с тем же диагнозом. Все соответствующие образцы пищевых продуктов были отобраны на месте, заморожены в холодильных устройствах и направлены в Национальный институт контроля пищевой продукции для анализа.

Выделение и идентификация штаммов B. cereus в образцах пиццы с говядиной. Определение B. cereus было выполнено в соответствии с международным стандартом ISO 7932: 2004³ (TCVN 4992: 2005), а именно 10 г каждого образца пищевого продукта были гомогенизированы в 90 мл пептонной воды (Merck). Для каждого образца была подготовлена серия растворов 10^-5, и 100 мкл каждого раствора были инокулированы на маннитол-агаре с добавлением яичного желтка и полимиксина (MYP; Merck). Инкубация во всех чашках продолжалась в течение одной ночи при температуре 37 °C. Колонии с типичными морфологическими признаками (плоские, диаметр – 2–3 мм, зубчатые края, розоватый цвет, окружены чистым пространством) были отобраны для гемолиза на кровяном агаре и биохимических тестов с применением углеводного набора API 50 (bioMerieux, Франция). Типичные колонии B. cereus , показавшие положительный результат в биохимических тестах, хранились при температуре -80 °C. Для идентификации эти колонии в виде тонких полосок были помещены на соевый агар Tryptone (TSA; Merck), инкубированы в течение 24 ч при 37 °C, а затем идентифицированы с применением метода матрично-активированной лазерной десорбции / ионизации – время пролетной детекции MALDI-TOF на приборе VITEK® MS

(BioMérieux SA, Marcy l’Etoile, Франция). В качестве контрольного штамма применялся E. coli ATCC 8739.

Оценка профиля лекарственной устойчивости штаммов B. cereus, обнаруженных в образцах пиццы с говядиной. Лекарственная устойчивость штаммов B. cereus была оценена при помощи метода диско-диффузии в тесте Кирби – Бауэра⁴. Бактерии B. cereus выращивались в 10 мл стерильного бульона с сердечно-мозговой вытяжкой до тех пор, пока плотность клеток не достигала 0,5 стандарта МакФарланда, что составляет примерно 1,5·10⁸ КОЕ/мл. Для распределения бактериальной суспензии на агаре Muller – Hinton применялся стерильный мазок. Согласно рекомендациям M45 CLSI было протестировано 11 типов антибиотиков, включая ампициллин (АМП, 10 мкг/диск), хлорамфеникол (Х, 30 мкг/диск), ципрофлоксацин (ЦИП, 5 мкг/диск), эритромицин (ЭРИ, 15 мкг/диск), имипенем (ИПМ, 10 мкг/диск), меропенем (МРП, 10 мкг/диск), офлоксацин (ОФК, 5 мкг/диск), пенициллин (ПРЛ, 10 МЕ/диск), стрептомицин (С, 10 мкг/диск), тетрациклин (ТЕ, 30 мкг/диск) и ванкомицин (ВАН, 30 мкг/диск). Диски были размещены на поверхности агара при помощи стерильных хирургических щипцов для последующей инкубации при температуре 37 °C в течение 18 ч. Результаты тестов на лекарственную устойчивость были получены при помощи измерения диаметра зоны подавления, представленной четко видимой областью вокруг диска с антибиотиком.

Определение генов токсинов B. cereus в образцах пиццы с говядиной. Метод экстракции ДНК. 10 штаммов B. cereus, выделенных из образов пиццы с говядиной, хранились при температуре -80 oC. Они были размещены тонкими полосками на кровяном агаре для обнаружения чистых штаммов, культивированных в бульоне с сердечно-мозговой вытяжкой (Brain Heart Infusion broth), и инкубированы в течение 18–24 часов при температуре 37 oC. Полная ДНК B. cereus была выделена в соответствии с протоколом для грамположительных бактерий для набора очистки геномной ДНК GeneJET (Thermofisher; C5042). Общая концентрация ДНК штаммов B. cereus была определена с применением наноспектрофотометра со спектральной поглощательной способностью 260 нм. До применения раствор ДНК хранился при температуре -20 oC.

ПЦР и мультиплексная ПЦР. Пары праймеров, использованных в рамках данного исследования для обнаружения генов рвотных и диарейных токсинов штаммов B. cereus , обнаруженных в образцах пиццы с говядиной, приведены в табл. 1. Простая ПЦР применялась для пар bceT-F/R, EM1F/R и cytK F/R, в то время как для оставшихся пар праймеров была использована мультиплексная ПЦР.

Смесь для ПЦР (25 мкл) состояла из 12,5 мкл мастер-смеси 2X PCR (Thermo Scientific), 1 мкл прямого праймера (10 пкмоль), 1 мкл обратного праймера (10 пкмоль), 3 мкл шаблона ДНК и 7,5 мкл деионизированной воды. Условия температурного цикла для пары праймеров EM1F / EM1R были определены следующим образом: 95 °C в течение 15 мин; (95 °C в течение 30 с; 60 °C на 30 с; 72 °C на 60 с) на 30 циклов, затем 72°C в течение 5 мин и удержание при 4 °C. Условия температурного цикла для пары праймеров bceT-F / bceT-R были определены следующим образом: 94 °C в течение 5 мин; (94 °C в течение 45 с; 55 °C на 45 с; 72 °C на 2 мин) на 30 циклов, затем

Таблица 1

Пары праймеров, использованные для обнаружения генов токсинов B. cereus

Наименование	Последовательность (5'-3')	Ген	Размер (по)	Ссылка
bceT-F	CGT ATC GGT CGT TCA CTC GG	Enterotoxin bceT	662	[12]
bceT-R	GTT GAT TTT CCG TAG CCT GGG
EM1F	GAC AAG AGA AAT TTC TAC GAG CAA GTA CAA T	NRPS	635	[13]
EM1R	GCA GCC TTC CAA TTA CTC CTT CTG CCA CAG T
nheAF	TAC GCT AAG GAG GGG C	nheA	499	[14]
nheAR	GTT TTT ATT GCT TCA TCG GCT
nheBF	CTA TCA GCA CTT ATG GCA G	nheB	769
nheBR	ACT CCT AGC GGT GTT CC
nhCF	CGG TAG TGA TTG CTG GG	nheC	581
nhCR	CAG CAT TCG TAC TTG CCA A
hblAF	GTG CAG ATG TTG ATG CCG AT	hbl A	1154
hblAR	ATG CCA CTG CCT GGA CAT A
HbICF	GAT ACT AAT GTG GCA ACT GC	hbl C	740
HbICR	TTG AGA CTG CTC GTT AGT TG
HbIDF	AAT CAA GAG CTG TCA CGA AT	hbl D	829
HbIDR	CAC CAA TTG ACC ATG CTA AT
CytK F	CGA CGT CAC AAG TTG TAA CA	Cytotoxin-K	565
cytK R	CGT GTG TAA ATA CCC CAG TT

4 Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method / A.W. Bauer, W.M. Kirby, J.C. Sherris, M. Turck // Am. J. Clin. Pathol. – 1966. – Vol. 45, № 4. – P. 493–496.

Таблица 2

Уровни загрязнения бактериями B. cereus (КОЕ/г) образцов пищевой продукции, отобранных в учреждениях А и В

Блюдо	Учреждение A	Учреждение B
Жареная свиная вырезка	Н/О	5,0 · 101
Смесь вареных овощей	Н/О	6,0 · 101
Лапша с яйцом и морепродуктами	Н/О	8,0 · 101
Пицца с говядиной	6,0 · 105	6,8 · 105

Примечание: Н/О – не обнаружено.

72 °C в течение 10 мин и удержание при 4 °C. Условия температурного цикла для пары праймеров cytKF / cytKR были определены следующим образом: 94 °C в течение 1 мин; (95 °C в течение 45 с; 54 °C на 1 мин; 72 °C на 2 мин) на 35 циклов, затем 72 °C в течение 5 мин и удержание при 4 °C.

Смесь для мультиплексной ПЦР (25 мкл) состояла из 12,5 мкл мастер-смеси 2X PCR (Thermo Scientific), 0,5 мкл каждого прямого праймера (20 пкмоль), 0,5 мкл каждого обратного праймера (20 пкмоль), 3 мкл шаблона ДНК и 3,5 мкл деонизи-рованной воды. Условия температурного цикла для амплификации мультиплексной ПЦР генов hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, и nheC были определены следующим образом: 94 °C / 2 мин; (95 °C / 15 с; 55 °C / 45 с; 72 °C / 2 мин) на 35 циклов, затем 72 °C / 5 мин и удержание при 4°C. Продукты ПЦР были разделены при помощи 1,5%-ного агарозного геля, приготовленного с применением буферного раствора 1X TAE и красителя Redsafe; подвергнуты процедуре электрофореза при 110 V в течение 50 мин с последующей УЗ-визуализацией. Для будущих исследований продукты ПЦР хранились при температуре -80 °C.

Результаты и их обсуждение. Выделение, идентификация и оценка загрязнения штаммами B. cereus образцов пиццы с говядиной, отобранных в дошкольных учреждениях A и B. Бактерия B. cereus была обнаружена в разных блюдах, но самые высокие ее концентрации – 6,0·10⁵ КОЕ/г в дошкольном учреждении A и 6,8·10⁵ КОЕ/г в дошкольном учреждении B (табл. 2) – были найдены в образцах пиццы с говядиной.

Следует отметить, что оба учреждения получали данное блюдо от одного и того же поставщика. В настоящее время во Вьетнаме отсутствуют стан- дарты безопасного уровня микроорганизмов в пицце. Что касается лимитов, установленных в других странах для уровней микробного загрязнения, следует упомянуть закон № 329 Республики Эстония, изданный в 2000 г., а также критерии микробиологической безопасности, установленные Национальным консультационным комитетом по микробиологическим стандартам для продуктов питания Департамента сельского хозяйства США. Согласно данным документам, максимальный уровень B. cereus в пицце5 или готовой еде [15] составляет 10³ КОЕ/г. Следовательно, предельно допустимый уровень был превышен в пицце с говядиной в дошкольных учреждениях А и В в 600 и 680 раз соответственно. Если же ориентироваться на допустимые уровни микробиологического загрязнения для готовой еды, установленные Кодексом пищевых стандартов Австралии и Новой Зеландии 20226, или Микробиологические рекомендации 2014 г., выпущенные Центром безопасности пищевых продуктов Гонконга7, то приемлемый уровень для готовой еды, установленный в них, составляет 105 КОЕ/г. Следовательно, уровни загрязнения в учреждениях А и В превышают этот предел в 6 и 6,8 раза соответственно. Помимо этого, концентрация B. cereus на уровне 5,0·101 КОЕ/г, 6,0·101 КОЕ/г и 8,0·101 КОЕ/г была обнаружена в жареной свиной вырезке, смеси вареных овощей и лапше с яйцом и морепродуктами соответственно в учреждении В (см. табл. 2), что говорит о потенциальной передаче бактерий из пиццы с говядиной в данные блюда. Для лучшего понимания эпидемиологических характеристик и разработки эффективных профилактических мер штаммы B. cereus, выделенные из образцов пиццы с говядиной в обоих дошкольных учреждениях, были проанализированы с целью определения уровней лекарственной устойчивости.

Результаты гемолитических тестов показали, что все выделенные штаммы продуцировали бета-гемолитические зоны, что является характерной чертой B. cereus (рис. 1). Результаты идентификации по методу MALDI-TOF, полученные для 10 колоний, выделенных из образцов пиццы с говядиной в дошкольных учреждениях А и В, показали, что для всех проанализированных колоний балльная оценка по шкале MALDI-TOF превысила 2,0, что позволяет идентифицировать все колонии как B. cereus (10/10; 100 %). Прочие биохимические характеристики штаммов оценивались при помощи набора API 50 CHE4, в результате все 100 % (10/10) штаммов B. cereus показали положительный результат

Рис. 1. Результаты гемолитического теста 10 штаммов B. cereus, выделенных из образцов пиццы с говядиной: 1–10 – выделенные штаммы B. cereus на D-рибосому, D-глюкозу, D-фруктозу, N-ацетил глюкозамин, арбутин, эскулин / железистый цитрат, салицин, D-мальтозу, D-трехалозу, крахмал (амидон) и гликоген. 80 % (8/10) штаммов показали положительный результат на D-целлобиозу; 70 % (7/10) штаммов – на D-сахарозу (сукрозу) и 50 % (5/10) – на гентиобиозу (табл. 3).

Эти результаты согласуются с данными, опубликованными в Руководстве Берджи по систематике бактерий. Ферментация глицерина, гликогена и крахмала, а также свойства редуцирования эскулина / железистого цитрата, подтвержденные в данном биохимическом тесте, как правило, применяются для дифференциации B. cereus от близкородственных бактерий Bacillus sp.⁸

Профиль лекарственной устойчивости штаммов B. cereus, выделенных из образцов пиццы с говядиной. Все штаммы ( n = 10; 100 %) оказались чувствительны к меропенему, а также показали высокую чувствительность к ципрофлоксацину ( n = 9; 90 %). Результаты показали средний уровень устойчивости штаммов B. cereus к офлоксацину ( n = 6; 60 %) и хлорамфениколу ( n = 7; 70 %). Штаммы B. cereus, выделенные из образцов пиццы с говядиной, показали абсолютную устойчивость к пенициллину ( n = 10; 100 %) и ванкомицину ( n = 10; 100 %); также высока была устойчивость к стрептомицину ( n = 9; 90 %), тетрациклину ( n = 8; 80 %), ампициллину ( n = 7; 70 %) и эритромицину ( n = 7; 70 %); устойчивость к имипенему была средней ( n = 6; 60 %) (рис. 2).

Согласно результатам тестирования, меропе-нем и ципрофлоксацин продемонстрировали перспективный уровень антимикробной активности в отношении штаммов B. cereus . В отличие от рекомендаций M45 CLSI, которые говорят о том, что B. cereus обычно устойчив к пенициллину, но зачастую чувствителен к ванкомицину и макролидам, в нашем исследовании было обнаружено, что штаммы B. cereus , выделенные из образцов пиццы с говядиной, показали 100%-ную устойчивость к ванкомицину 70%-ную – к эритромицину. M.N.S. Abdelaziz et al. (2024) изучили лекарственную устойчивость

Таблица 3

Доля штаммов B. cereus ( n = 10) с положительным результатом тестов с применением набора API 50 CH

№	Тест	Конц., мг	%	№	Тест	Конц., мг	%
0	Отрицательный контроль		0	25	Эскулин / железистый цитрат	1,16 / 0,152	100
1	Глицерин	1,64	100	26	Салицин	1,04	100
2	Эритрол	1,44	0	27	D-целлобиоза	1,32	80
3	D-арабиноза	1,4	0	28	D-мальтоза	1,4	100
4	L-арабиноза	1,4	0	29	D-лактоза	1,4	0
5	D-рибоза	1,4	100	30	D-мелибиоза	1,32	0
6	D-ксилоза	1,4	0	31	D-сахароза	1,32	70
7	L-ксилоза	1,4	0	32	D-трехалоза	1,32	100
8	D-адонитол	1,36	0	33	Инулин	1,28	0
9	Метил-ß-D-ксилопиранозид	1,28	0	34	D-мелецитоза	1,32	0
10	D-галактоза	1,4	0	35	D-раффиноза	1,56	0
11	D-глюкоза	1,56	100	36	Крахмал	1,28	100
12	D-фруктоза	1,4	100	37	Гликоген	1,28	100
13	D-манноза	1,4	0	38	Ксилитол	1,4	0
14	L-сорбоза	1,4	0	39	Гентиобиоза	0,5	50
15	L-рамноза	1,36	0	40	D-тураноза	1,32	0
16	Дульчитол	1,36	0	41	D-ликсоза	1,4	0
17	Инозитол	1,4	0	42	D-тагатоза	1,4	0
18	D-маннитод	1,36	0	43	D-фукоза	1,28	0
19	D-сорбитол	1,36	0	44	L-фукоза	1,28	0
20	Метил-α-D-маннопиранозид	1,28	0	45	D-Arabitol	1,4	0
21	Метил-α-D-глюкопиранозид	1,28	0	46	L-арабитол	1,4	0
22	N-ацетил глюкозамин	1,28	100	47	Глюконат калия	1,84	0
23	Амигдалин	1,08	0	48	Калий 2-кетоглюконат	2,12	0
24	Арбутин	1,08	100	49	Калий 5-кетоглюконат	1,8	0

8 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Volume One: The Archaea and the Deeply Branching and Phototrophic Bacteria / ed. by D.R. Boone, R.W. Castenholz, G.M. Garrity. – NY: Springer Publ., 2001. – 2nd ed. – 722 p.

■ Nhay ■ Trung gian ■ Khang

Рис. 2. Профиль лекарственной устойчивости B. cereus , определенный на основании диаметра зоны подавления (мм): красный – устойчивость, розовый – промежуточное состояние, коричневый – чувствительность

штаммов B. cereus , обнаруженных в пищевых продуктах в Японии, и обнаружили высокие уровни устойчивости к ванкомицину [16], что согласуется с данными нашего исследования. T. Nakayama (2021) показал, что штаммы B. cereus , выделенные из куриного мяса в городе Хо Ши Мин, обладали устойчивостью к ампициллину, ципрофлоксацину и тетрациклину [17], в то время как штаммы B. cereus , изученные в данном исследовании, были чувствительны к ципрофлоксацину и обладали устойчивостью к ампициллину и тетрациклину. При сравнении профиля лекарственной устойчивости 10 штаммов B. cereus , выделенных из образцов пиццы с говядиной при инциденте с пищевым отравлением в детском саду, и глобально циркулирующих штаммов B. cereus было обнаружено, что наши результаты подобны данным исследования A.M. Algammal et al. (2022). Штаммы B. cereus , циркулирующие в Египте, обладали чувствительностью к меропенему и показали устойчивость к нескольким антимикробным препаратам, включая эритромицин, стрептомицин и тетрациклин [18], подобно штаммам B. cereus , описанным в рамках данного исследования. Необходимы дальнейшие исследования вирулентности и генов лекарственной устойчивости на уровне ДНК для тщательного изучения эпидемиологических характеристик и внедрения эффективных мер профилактики против штаммов B. cereus , обнаруженных в образцах пиццы с говядиной.

Присутствие генов токсинов B. cereus в образце пиццы с говядиной. 10 штаммов B. cereus, выделенных из образцов пиццы с говядиной, связанные с инцидентом с пищевыми отравлениями в дошкольных учреждениях А и В в Ханое, были проанализированы на наличие генов рвотных (NRPS) и диарейных (hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, nheC, bceT и cytK) токсинов при помощи ПЦР (NRPS, bceT и cytK) и мультиплексной ПЦР (hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, и nheC). Результаты электрофореза (рис. 3–5) показали, что 100 % штаммов B. cereus (10/10), выделенных из образцов пиццы с говядиной, дали положительный результат на наличие гена bceT, 80 % (8/10) – гена cytK, и 60 % штаммов (6/10) – на наличие генов nheA и nheC. Кроме того, 100 % штаммов, изученных в данном исследовании (10/10), дали отрицательный результат на наличие гена NRPS (данное электрофорез-изображение не включено в исследование).

M 1    2    3     4    5    6    7     8   9   10 (l)   (-)

Рис. 3. Электрофорез продукта ПЦР гена токсина bceT : 1–10 – bceT – позитивен (662 по); M – лестница ДНК 50 по; (+) – положительный контроль; (-) – отрицательный контроль

Рис. 4. Электрофорез продукта ПЦР гена токсина cytK : 1, 6 – отрицательно; 2–5 и 7–10 – cytK – позитивен (565 по); M – лестница ДНК 50 по; (-) – отрицательный контроль

Рис. 5. Электрофорез-изображения продуктов мультиплексной ПЦР генов токсинов hbl ( hblA , hblC , и hblD ) и nhe ( nheA , nheB , и nheC ): 1–4 – отрицательно; 5–10 – nhA и nhC позитивен (581 по, 499 по);

M – лестница ДНК 50 по; (-) – отрицательный контроль

Результаты нашего исследования согласуются с данными, описанными другими авторами в разных странах. В Ираке B.M.S. Saeed et al. (2021) описали очень низкий уровень обнаружения рвотного токсина во всех образцах пищевых продуктов, примерно на уровне 7,69 %, что говорит о низкой распространенности штаммов B. cereus с рвотным типом токсинов в пищевых продуктах [14]. N. Jessberger et al. (2021) [19] и M. Bağcioğlu et al. (2019) [20] также обнаружили, что рвотный тип B. cereus обнаруживался в пищевых продуктах значительно реже, чем диарейный. Наше исследование вносит определенный вклад в базу данных по штаммам B. cereus, циркулирующим во Вьетнаме. Более того, данные о штаммах B. cereus , несущих ген диарейного токсина, идентифицированных в рамках данного исследования, являются ценным ресурсом для разработки справочных материалов, необходимых для быстрой диагностики пищевого отравления вызывающими диарею бактериями типа B. cereus .

Выводы. В рамках данного исследования 10 штаммов B. cereus были выделены из образцов пиццы с говядиной и определены в качестве причины пищевого отравления дошкольников, посещающих учреждения А и В в Ханое. Выявленные уровни загрязнения B. cereus превышали допустимые уровни, установленные международными регулирующими документами; они составили 6,0·105 КОЕ/г в учреждении A и 6,8·105 КОЕ/г в учреждении B. В тестах с использованием 11 антибиотиков с целью определе- ния уровней лекарственной устойчивости выделенных штаммов было обнаружено, что бактерии B. cereus обладали абсолютной устойчивостью (100 %) к пенициллину и ванкомицину, высоким уровнем устойчивости к стрептомицину (90 %), тетрациклину (80 %), ампициллину (70 %) и эритромицину (70 %); средним уровнем устойчивости к ими-пенему (60 %) и были чувствительны к меропенему (100 %) и ципрофлоксацину (90 %). Кроме того, 100 % штаммов B. cereus (10/10), обнаруженных в образцах пиццы с говядиной, дали положительный результат на ген токсина bceT, 80 % (8/10) – на ген токсина cytK, и 60 % штаммов (6/10) – на гены токсинов nheA и nheC, что указывает на принадлежность выделенных штаммов B. cereus к диарейному типу. Бактерия B. cereus остается основной патогенной угрозой по причине ее стремительной эволюции, носительства генов вирулентности и лекарственной устойчивости, что говорит о необходимости постоянного мониторинга генетического профиля и лекарственной устойчивости штаммов, циркулирующих во Вьетнаме, с целью предотвращения заболеваний и реагирования на возникающие вспышки отравлений.

Финансирование. Авторы выражают глубокую благодарность Национальному институту контроля пищевой продукции, Вьетнам, за предоставленное финансирование.