Выделение клеточных популяций из периферической крови сельскохозяйственных животных

Для биологических исследований и точной диагностики заболеваний сельскохозяйственных животных часто требуется разделение периферической крови на фракции и получение чистых популяций клеток. Способы разделения крови на клеточные популяции были разработаны в основном на лабораторных животных (1, 2). Наиболее распространенный метод выделения лимфоцитов и гранулоцитов предложен A. Boyum (1). Существующие приемы получения тромбоцитов из крови лабораторных животных основаны на гельфильтрации плазмы через колонки с сефарозой 2В (3), центрифугировании с водонерастворимым гелеобразным материалом (4) и разделении клеток крови в градиенте плотности перколла (5). В литературе отсутствуют сведения о пригодности этих методов для выделения клеток из периферической крови сельскохозяйственных животных, к тому же перечисленные процедуры трудоемки и длительны. Известно также, что при выделении тромбоцитов из обогащенной клетками плазмы крови сельскохозяйственных животных отмечается агрегация клеток (6).

В связи с этим целью нашей работы была разработка способа выделения популяций лимфоцитов, тромбоцитов и нейтрофилов из периферической крови сельскохозяйственных животных.

Описание методики . За основу был взят метод центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (7). Согласно прописи образцы крови овец наслаивали на раствор фиколл-верографина с удельной плотностью 1,077 г/см³ и центрифугировали при

400 g в течение 40 мин при 0 ° С. Однако при этом нам не удалось получить выраженного разделения фракций, так как слой фиколл -верографина оказался заполненным эритроцитами. Для их удаления образцы обрабатывали декстраном 500, хлоридом аммония (NH 4 Cl) и поливинилпирролидоном. При оптимальной концентрации декстрана 500 не наблюдалось заметного ускорения осаждения эритроцитов. Добавление к крови 8-кратного объема 0,84 % NH 4 Cl позволило эффективно удалять эритроциты, но при этом не происходило заметного разделения лимфоцитов и нейтрофилов (табл. 1). После предварительного осаждения эритроцитов 0,6-0,8 % раствором поливинилпирролидона и центрифугирования плазмы, обогащенной клетками белой крови, с применением градиента плотности фи-колл-верографина была получена популяция лимфоцитов со степенью чистоты 96 %, но выход клеток при этом достигал лишь 2 % (количество клеток в полученных суспензиях подсчитывали по стандартным методикам (8); жизнеспособность клеточных популяций оценивали в тесте с трипановым синим).

1. Содержание компонентов (%) во фракции лейкоцитов овец, выделенной центрифугированием в градиенте плотности с использованием различных реагентов

Фиколл-верографин          31 ± 2          68 ±4            —

Верографин                  99 ± 1            1 ± 1              —

П р и м е ч а н и е. Прочерк означает практически полное отсутствие эозинофилов.

Итак, центрифугирование образцов крови в градиенте плотности фиколл-верографина не позволило выделить лимфоциты, вероятно, из-за того, что одним из свойств фиколла является увеличение скорости седиментации эритроцитов при центрифугировании. Однако при применении разведенной крови также не происходило полного осаждения эритроцитов. Последнее (с учетом отсутствия увеличения скорости седиментации эритроцитов при добавлении к цельной крови декстрана 500) указывает на возможность дезагрегирующего эффекта фи-колла.

В связи с этим нами была предпринята попытка выделения лимфоци

2. Выход клеток (по содержанию белка в лизате, мг) из 10 мл цельной крови овец при центрифугировании с различными градиентообразующими веществами

В ходе даль-нейших лабораторных исследований было выявлено, что вместо верографина могут использоваться его аналоги — три-омбраст и урографин. Разработанный и описанный выше способ подходит для разделения клеток крови и выделения чистых популяций лимфоцитов, тромбоцитов и нейтрофилов из периферической крови не только овец, но и крупного рогатого скота (бычков, коров, телят), свиней, лошадей.

Таким образом, нами предлагается следующий метод выделения популяций лимфоцитов, тромбоцитов и нейтрофилов из периферической крови сельскохозяйственных животных. Периферическую кровь отбирают из яремной вены в пробирку, в которую в качестве антикоагулянта добавляют цитрат натрия в конечной концентрации 0,38 %. Образцы крови (3 мл) наслаивают на равный объем (3 мл) раствора изоплотностного вещества (верографин, урографин или триомбраст) с удельной плотностью 1,077 г/см3 и центрифугируют при 400 g и 20 °С в течение 15 мин. В результате центрифугирования образцов крови содержимое пробирки разделяется на три части: в нижней содержится фракция эритроцитов, в средней — слой изоплотностного вещества с лимфоцитами и тромбоцитами, в верхней — плазма крови. Нейтрофилы образуют белую пленку на поверхности фракции эритроцитов. В последующем нужные фракции отбирают стеклянной или автоматической пипеткой и используют по назначению. Лимфоциты отделяют от тромбоцитов посредством 4-кратного центрифугирования при 200 g и 20 °С в течение 10 мин в среде для промывки, содержащей NaCl (145 мМ), KCl (5 мМ), K2HPO4 (0,5 мМ), MgCl2 (1 мМ), глюкозу (3 мМ) и 5-N-2-(гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (10 мМ); рН 7,4. Осадок эритроцитов вместе с нейтрофилами подвергают лизису в Н2О в течение 10 мин, после чего лизированные эритроциты удаляют центрифугированием при 200 g и 20 °С в течение 10 мин, а нейтрофилы отмывают центрифугированием в среде для промывки при 200 g в течение 10 мин.

Предложенный способ выделения клеточных популяций из периферической крови сельскохозяйственных животных с применением центрифугирования в градиенте плотности имеет следующие преимущества. В качестве градиентообразующего вещества можно использовать не только верографин, но и его аналоги — урографин и триомбраст. Из одного образца крови выделяются практически чистые популяции лимфоцитов, тромбоцитов и нейтрофилов, выход которых составляет соответственно 85,3-96,6; 82,2-97,8 и 84,791,8 %. Выделенные клетки не повреждаются и полностью сохраняют нативные свойства в течение 4-5 ч. Достигается ускорение и удешевление процедуры выделения клеток. Способ пригоден для работы не только в лабораторных, но и полевых условиях, поскольку для разделения клеток можно использовать переносную настольную центрифугу, набор пробирок и пипеток без применения стационарного оборудования.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.   B o y u m A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. I. Clin. Invest. 1968, 21 (suppl. 97): 77-89.

• 2.   М е с и н у Н., П ы д е р О., Т э д е р А. Определение Т-субпопуляции лимфоцитов в крови и лимфе методом розеткообразования. Изв. АН ЭССР. Сер. Биология,

  1981, 30(1): 1-6.

• 3.    L a g e s B., S c h r u t t o n M.C., H o l m s e n H. e.a. Metall ion contents of gel-filtred platelets from patients with storage pool discase. Blood, 1975, 46: 119-130.

• 4.    Патент США. ¹ 4190535. 26.02.1982.

• 5.    L i n d e n a I., S o m m e r f e l d U., H o p f e d C. e.a. Enzyme activities in blood cell of dog and dogs after separation on a discontinuous percoll gradient. Enzyme, 1983, 29: 100-108.

• 6.    C l e m m o n s R.M., B l i s s E.L., D o r s e y - L e e M.R. e.a. Platelet function, size and yield in whole blood and platelet-rich plasma, prepared using differing centrifugation force and time in domestic and food-producing animals. Throm. Haemostas, 1983, 50: 838-843.

• 7.   И л ь и н Н.В., В а т т е н к о в Б.О., Л е ц к и й В.Г. Субпопуляция лимфоцитов в лимфатических узлах здорового человека. Лаб. дело, 1980, 8: 486-488.

• 8.   К у д р я в ц е в А.А., К у д р я в ц е в а Л.А. Клиническая гематология животных. М., 1974.

ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной радиологии Поступила в редакцию и агроэкологии РАСХН,                                    11 декабря 2006 года

249020 Калужская область, г. Обнинск, Киевское ш., 109 км,

S u m m a r y

A procedure is suggested to isolate pure populations of lymphocytes, neutrophils, thrombocytes from the peripheral blood of agricultural animals (sheep, horses, cattle). Sequential stages are described in the development of procedure for blood separation into cellular fractions. It was shown that this technique have following advantage: for gradient may be use the analogs of verografin — urografin and triombrast. From one sample of blood practically pure populations of lymphocytes, thrombocytes and neutrophils are isolated, the yield of which are 85,3-96,6; 82,2-97,8 и 84,791,8 %, respectively. The isolated cells are not damaged and retain entirely their native properties for 4-5 hours.