Выявление ОМИК-маркеров для прогнозирования риска развития негативных эффектов у детей с повышенным содержанием меди и никеля в крови

• ¹    Об утверждении Стратегии развития медицинской науки в Российской Федерации на период до 2025 года: Распоряжение Правительства Российской Федерации от 28 декабря 2012 года № 2580-р [Электронный ресурс] // Гарант.Ру. Информационно-правовой портал. – URL: https://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/70192396/ (дата обращения: 20.09.2019).

В условиях особого высокого уровня загрязнения атмосферного воздуха химическими веществами, к числу которых относятся высокотоксичные соединения никеля и меди, существует риск развития негативных эффектов со стороны органов дыхания, системы крови, иммунной и нервной систем2.

В связи с этим особую значимость приобретает идентификация изменений гомеостаза на молекулярном уровне. Этим требованиям в полной мере соответствуют исследования пептидных пулов, играющих исключительную роль в биорегуляции в живых организмах. Эффективным инструментом, позволяющим выполнить анализ самих пептидов, их конечных и промежуточных метаболитов в клетке, является технология протеомного профилирования [1–4]. Данный метод позволяет исследовать и обосновывать молекулярные этиопатогенетические механизмы возникновения и развития ответных реакций организма на негативные воздействия на самых ранних стадиях их формирования, еще до возникновения симптомов клеточного и органного поражения, то есть на уровне трансформированного проте-омного профиля плазмы крови. Для прогнозирования экспрессии данных пептидов важным является определение генов, их кодирующих, что возможно с помощью существующих баз данных (например Sviss Prot). Обозначенная проблема обусловливает актуальность исследований, направленных на идентификацию молекулярных омик-маркеров с целью раннего выявления и профилактики последствий, ассоциированных с аэрогенным воздействием металлов [5, 6].

Цель исследования – выявление омик-марке-ров для прогнозирования риска развития негативных эффектов у детей с повышенным содержанием меди и никеля в крови.

Материалы и методы. Объектом исследования являлись образцы плазмы крови 20 детей в возрасте 4–6 лет, имеющих повышенное содержание меди и никеля в крови (группа наблюдения), и 10 детей этого же возраста с содержанием в крови изучаемых химических веществ, соответствующих минимальным или референтным значениям (группа контроля).

Настоящие исследования выполнены с соблюдением этических требований Хельсинкской декларации (ред. 2013 г.) и одобрены этическим комитетом ФБУН «Федеральный научный центр медикопрофилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора. Сравниваемые группы сопоставимы по гендерному признаку, возрастному критерию и не имеют различий по социально-экономическим факторам риска здоро- вью. Законные представители детей добровольно подписали информированное согласие на участие и публикацию данных несовершеннолетних, участвующих в обследовании.

Химико-аналитическое исследование крови на содержание никеля и меди осуществляли в соответствии с действующими в Российской Федерации методическими указаниями МУК 4.1.3230-14 «Измерение массовых концентраций химических элементов в биосредах (кровь, моча) методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой»3. Использовано аналитическое оборудование: масс-спектрометр с индуктивно связанной аргоновой плазмой Agilent 7500cx (США).

Исследование протеомного профиля плазмы крови детей группы наблюдения и контроля выполнено по технологии двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле в соответствии с методиками, рекомендованными для используемого оборудования [7–9]. Полученные электрофореграммы плазмы крови визуализировали методом окраски серебром и документировали с помощью системы для гель-документирования (BioRad, США). Анализ полученных протеомных карт проводили с помощью программного комплекса PDQuest (Bio-Rad, США). В полученной протеинограмме выделяли значимые белковые пятна по их интенсивности и проводили последующий анализ методом жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (на хроматографе UltiMate 3000 (Германия) и тандемном масс-спектрометре ABSciex 4000 QTRAP с источником ионизации Nanospray 3 (Канада)). Данные тандемных экспериментов обрабатывались программой ProteinPilot, версия 4.5 (AB SCIEX), c идентификацией по базе данных UniProt_sprot_fasta (от 24.11.2017), с выборкой по таксону Homo Sapience. Основная часть информации о полученных белках экстрагирована из баз данных UniProt. Установление гена, которому соответствует идентифицированный белок, выполнено с помощью базы данных HGNC database of human gene name.

Характеристики выборок представляли в виде среднего значения ( М ) и ошибки репрезентативности ( m ). Статистическую значимость различий переменных между группами наблюдения и сравнения определяли по критерию Манна – Уитни. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ Statistica 10.

Для сопоставительного анализа прогнозируемых негативных эффектов в исследуемой выборке (возраст 4–6 лет) использовали оценку заболеваемости детей в возрасте 10–12 лет (по МКБ-10) по данным углубленных исследований.

Маркерные белковые пятна обосновывали на основании полученных достоверных причинно-следственных связей, описываемых многофакторными моделями зависимости «статистически значимое пятно – концентрация никеля и меди в крови» с помощью линейной регрессии. Достоверность и адекватность полученных моделей оценивали на основе дисперсионного анализа с использованием F -критерия Фишера, коэффициента детерминации ( R ²), t -критерию Стьюдента при статистической значимости p ≤ 0,05.

Результаты и их обсуждение. Анализ результатов химико-аналитических исследований крови на содержание никеля и меди позволил установить, что у детей в группе наблюдения выявлен повышенный в 1,2 раза уровень меди (1,04 ± 0,09 мг/дм³) по сравнению с его концентрацией (0,87 ± 0,09 мг/дм³) в группе контроля ( р = 0,011), а также увеличение содержания никеля в крови (0,007 ± 0,002 мг/дм³) до 3,5 раза относительно значения показателя (0,002 ± ± 0,0001 мг/дм³) в контрольной группе ( р = 0,001). Доля проб с содержанием меди и никеля в крови выше референтных значений⁴ ( RfL меди = 0,09 мг/дм³,

RfL никеля = 0,001 мг/дм³) составила от 77,0 до 82,0 % от общего числа обследованных детей, в то время как в группе контроля от 10,0 до 20,0 % проб.

В результате проведения двумерного электрофореза получены протеомные карты плазмы крови детей исследуемых выборок, в которых денситометрически определены относительные объемы белковых пятен (рис. 1).

Сравнительный анализ результатов денсито-метрического измерения протеомных карт плазмы крови обследуемых детей позволил выявить наличие достоверных различий относительного объема порядка 20 белковых пятен у детей группы наблюдения относительно соответствующих данных группы контроля (табл. 1).

У детей группы наблюдения установлено увеличение в 8,0–12,2 раза объема белковых пятен № 12 и № 18, а также уменьшение в 5,4 раза объема пятна № 19 относительно аналогичных пятен у детей в группе контроля ( р = 0,0001). Выделенные белки и гены, кодирующие их экспрессию, представлены в табл. 2.

а

Рис. 1. Фрагмент 2D-геля плазмы крови детей с указанием номера белковых пятен: а – индивид группы наблюдения, ; б – индивид группы контроля

б

Таблица 1

Спектр пептидов и белков, выделенных в протеомном профиле плазмы крови детей с повышенным содержанием меди и никеля в крови

Номер пятна	Спектр пептида	Вероятность идентификации пептида, %	Наименование белка
№ 2	RVDGSVDFYRDWATYK	1,0	Фиколин-2
	VDLVDFEDNYQFAK	56,6
№ 4	VDGSVDFYR	88,0	Фиколин-2
	VDLVDFEDNYQFAK	99,0
	VNVDEVGGEALGR	99,0	Бета-субъединица гемоглобина
№ 8	INGKPLPGATPAK	40,6	тРНК селеноцистеин 1-ассоциированный белок 1

4 Тиц Н.У. Клиническое руководство по лабораторным тестам. – М.: ЮНИМЕД-пресс, 2003. – 570 c.

Окончание табл. 1

Номер пятна	Спектр пептида	Вероятность идентификации пептида, %	Наименование белка
№ 9	GLCVATPVQLR	99,0	Дополнение C4-B
	GSFEFPGDVSK	64,9
	LGQYASPTAKRCCQDGVTR	1,0
	QRIEALSLMHPSISFSLR	59,0	Белок репарации несоответствия ДНК Mlh3
	DSEATR	1,0
	FYGFR	1,0
	GVGKVPR	34,1	P2Y-пуриноцептор 12
№ 10	NIVQNVR	26,1	Сидерофлексин-3
№ 11	VSFLSALEEYTK	99,0	Аполипопротеин A-I
	QGLLPVLESFK	33,6
	VKDLATVYVDVLK	3,8
	VDTLEIQGDVTLSYVQIR	32,2	Галектин-4
№ 12	DYVSQFEGSALGK	99,0	Аполипопротеин A-I
	QGLLPVLESFK	59,9
	LLKILLEVVK	52,3	Якорный белок А-киназы 9
№ 13	CYTAVVPLVYGGETK	99,0	J-цепь иммуноглобулина
	FVYHLSDLCK	99,0
	AVHVKAQEDER	1,0
	NHLLFWGVLAFIK	1,0
	RPSTPR	73,2	Белковый фагот
	EKQFLNAESAYMDPMK	0,2
	DRGGRDYPPLR	1,0
	DSTSTAPDSQR	0,1
	LEPLGPGSSGRPGK	1,0
	VLRDGGCSLPIIPNITK	0,2
	HRAAEAAINILK	72,9	Интерферон-индуцируемый активатор двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы A
№ 15	GLEEELQFSLGSK	99,0	Дополнение C4-B
	DVPRGQVVK	1,0
	HQDFNSAVQLVENFCR	99,0	Протромбин
	LAVTTHGLPCLAWASAQAK	18,3
№ 16	GLEEELQFSLGSK	99,0	Дополнение C4-B
	MPYSVGFR	23,6	Анкирин-1
	CYGMTDDKVDK	1,0
№ 17	SIAQYWLGCPAPGHLR	77,2	Витронектин
№ 18	SIAQYWLGCPAPGHLR	95,9	Витронектин
№ 19	GSPAINVAVHVFR	99,0	Транстиретин
	TSESGELHGLTTEEEFVEGIYK	99,0
	ALGISPFHEHAEVVFTANDSGPR	94,7
	AADDTWEPFASCK	99,0
№ 22	DALSSVQESQVAQQAR	99,0	Аполипопротеин C-III
	GWVTDGFSSLK	99,0
	DLTEAVPR	94,1	Миотубулярин
	RDGPGLER	42,7	НАД-зависимый протеин-деацетилаза сиртуин-1
	LKSGSGPVR	32,4	Нуклеоплазмин-3
№ 23	SIAQYWLGCPAPGHLR	99,0	Витронектин
	DALSSVQESQVAQQAR	3,9	Аполипопротеин C-III
	GWVTDGFSSLK	42,2
№ 24	ESLSSYWESAK	99,0	Аполипопротеин C-II
№ 27	FFGHGAEDSLADQAANEWGR	96,5	Сывороточный амилоидный белок А-1
	FFGHGAEDSLAPQAANEWGR	1,0
	RGPGGAWAAEVISNAR	93,0	Сывороточный амилоидный белок А-2
№ 28	SFFSFLGEAFDGAR	99,0	Сывороточный амилоидный белок А-2
	LVAASQAALGLK	79,1	Альбумин
	APLAKYIGENQDSISSK	1,0
	YIGENQDSISSKLK	1,0
	VFDEFKPLVEEPQNLIK	99,0
№ 30	SAVTALWGK	99,0	Бета-субъединица гемоглобина
	VNVDEVGGEALGR	99,0
	VLGAFSDGLAHLDNLK	55,6
№ 31	LLVVYPWTQR	99,0	Субъединица гемоглобина гамма-2

Таблица 2

Пример спектра одного из пептидов, имеющего связь с повышенным содержанием одновременно меди и никеля в крови, представлен на рис. 2.

При построении многофакторных моделей установлены прямые причинно-следственные связи между повышенным содержанием в крови меди, никеля и увеличением относительного объема белкового пятна № 12, включающего последовательность белка аполипопротеина A-I и якорного белка А-киназы 9 ( R ² = 0,30; b 0 = –656,8; b 1 = 1801,1; b 2 = 63518,1; р = 0,008) и белкового пятна № 18 (витронектин) ( R ² = 0,44; b 0 = –1372,0; b 1 = 2743,3; b 2 = 112937,0; р = 0,0001). Выявлена также обратная зависимость уменьшения относительного объема белкового пятна № 19, включающего транстиретин, от повышенного содержания меди и никеля в крови ( R ² = 0,35; b 0 = 4870,1; b 1 = –3266,9; b 2 = –79946,5; р = 0,003).

Анализ биологической функции идентифицированных белков плазмы крови по данным отечественной и зарубежной научной литературы позволяет прогнозировать развитие ряда негативных эффектов со стороны сердечно-сосудистой и нервной систем. Так, установленные белки аполипопротеин A-I и витронектин характеризуют преимущественно дисфункцию эндотелия, что в дальнейшем может способствовать развитию артериальной гипертонии и

кардиомиопатии [10]. Аполипопротеин A-I - липопротеин высокой плотности, обеспечивает освобождение клеток от избытка холестерина, тем самым предотвращает образование атеросклеротических бляшек и способствует повышению эластичности эндотелия сосудов [11–13]. Витронектин – это клеточно-адгезивный гликопротеин, продуцируемый и секретируемый клетками печени, который в патологических условиях ассоциируется с клеточными поверхностями, например, с активированными тромбоцитами и с внеклеточными матрицами различных тканей (фибрин) [14]. В результате происходит усиление адгезии тромбоцитов и их местной агрегации, что подтверждается данными экспериментальных исследований [15, 16]. При увеличении относительного объема белкового пятна, содержащего аполипопротеин A-I и витронектин, в условиях повышенной концентрации в крови меди и никеля, можно прогнозировать повреждение эндотелиальных клеток кровеносных сосудов активными формами кислорода, запуск провоспалительной реакции и освобождение цитокинов из тканей сердца, через транскрипционные факторы NF-κB (ядерный фактор «каппа-би») и AP-1 (белок-активатор 1), что представлено в ряде зарубежных и отечественных научных работ [17, 18].

Белки и кодирующие их гены, имеющие связь с повышенным содержанием меди и никеля в крови

Номер белкового пятна	Направление изменения объема белкового пятна	Наименование белка	Относительный объем * белкового пятна ( M ± m ), int		Ген, кодирующий белок	Код гена, кодирующего белок, в базе данных Sviss Prot
			группа наблюдения ( n = 20)	группа контроля ( n = 10)
12	увеличение	Аполипопротеин A-I	2099 ± 135**	171 ± 46	APOA1	P02647
		Якорный белок А-киназы 9			AKAP9	Q99996
18	увеличение	Витронектин	2731 ± 337**	340 ± 101	VTN	P04004
19	уменьшение	Транстиретин	498 ± 143**	2687 ± 746	TTR	P02766

П р и м е ч а н и е :

int* – интенсивность белкового пятна;

**

– достоверность различий средних значений, р ≤0,05.

Рис. 2. Спектр пептида TSESGELHGLTTEEEFVEGIYK (Транстиретин) (база данных SwissProt) плазмы крови ребенка в пятне № 19

Якорный белок А-киназы 9 характеризует изменения в нейрорегуляции, поскольку ряд изоформ данного белка способен связываться с рецептором N-метил-D-аспартата в нервно-мышечном соединении и синапсах нейронов, что предполагает изменение в организации постсинаптической специализации [19]. По данным экспериментальных исследований избыточная экспрессия установленного белка может приводить к увеличению длины митохондрий и мембранного потенциала, что снижает чувствительность нейронов к постоянному напряжению в передаче сигналов [19, 20]. В свою очередь известно, что танстиретин – белок, играющий важную роль в развитии нервной системы, нейрональном росте и синаптогенезе, регуляции цитоархитектоники, обеспечивающих когнитивные функции центральной нервной системы (память, эмоциональное состояние, психическое здоровье) [21, 22]. Данное предположение подтверждают результаты зарубежных экспериментальных исследований [21, 23]. Следствием изменения экспрессии транстиретина являются возможные когнитивные нарушения и поведенческие отклонения [23].

По результатам сопоставительного анализа установленных изменений протеомного профиля плазмы крови детей в возрасте 4–6 лет и негативных эффектов, фактически реализованных, у детей в возрасте 10–12 лет выявлена достоверно повышенная в 2,2–3,0 раза частота встречаемости заболеваний по классу болезней сердечно-сосудистой (кардиомиопатии: I42) и нервной систем (функциональные расстройства центральной и вегетативной нервной систем: G90.9, G90.8) относительно соответствующих показателей в группе контроля ( р = 0,001–0,032). При этом у детей старшей возрастной категории установлены достоверные зависимости повышения частоты встречаемости заболеваний нервной системы в виде функциональных расстройств и кардиомиопатий от повышенного содержания в крови меди и никеля ( R ² = 0,35–0,96; –1,94 ≤ b 0 ≥ –7,22; 1,76 ≤ b 1 ≥ 128,64; р = 0,0001–0,013).

Таким образом, обоснованные омик-маркеры (аполипопротеин A-I, витронектин, якорный белок А-киназы 9, транстиретин) и гены, кодирующие их экспрессию (APOA1, VTN, AKAP9, TTR), могут быть использованы для повышения эффективности

прогнозирования развития негативных эффектов, связанных с нарушением нейрорегуляции и эндотелиальной дисфункции с целью раннего выявления и профилактики негативных последствий со стороны здоровья у детей в условиях высокой аэрогенной нагрузки меди и никеля.

Выводы:

• 1.    У детей с повышенным до 3,5 раза содержанием в крови меди и никеля выявлено порядка двадцати белковых пятен, достоверно отличающихся от таковых у детей группы контроля.

• 2.    Установлены зависимости увеличения относительного объема трех белковых пятен, включающих аполипопротеин A-I, якорный белок А-киназы 9, витронектин, и уменьшения относительного объема одного белкового пятна, включающего транстиретин, от повышенного содержания в крови меди и никеля ( R ² = 0,30–0,44; р = 0,0001–0,008).

• 3.    Изменения относительного объема белковых пятен, включающих аполипопротеин A-I, якорный белок А-киназы 9, витронектин и транстиретин, являются прогностически значимыми для развития негативных эффектов, связанных с нарушением нейрорегуляции и эндотелиальной дисфункцией.

• 4.    Доказана реализация прогнозируемых негативных эффектов в виде повышения частоты развития заболеваний нервной и сердечно-сосудистой системы при повышенной концентрации в крови меди и никеля ( R ² = 0,35–0,96; р = 0,0001–0,013).

• 5.    Для прогнозирования вероятности развития негативных эффектов со стороны сердечно-сосудистой и нервной систем до формирования тканевых и органных поражений обоснован перечень омик-маркеров в виде белков (аполипопротеин A-I, витронектин, якорный белок А-киназы 9, транстиретин) и генов, кодирующих их экспрессию (APOA1, VTN, AKAP9, TTR), позволяющий идентифицировать трансформированный протеомный профиль, ассоциированный с аэрогенным воздействием никеля и меди.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.