Выявление ротавируса свиней методом полимеразной цепной реакции

На основе антигенных связей последовательностей VP6 вирус классифицируется по 10 группам (A-J) [6].

У свиней зарегистрировано 5 групп ротавирусов (RVА, RVB, RVС, RVЕ, RVН), среди которых группы A, B и C встречаются чаще всего, поражают человека и животных. Наибольшую распространенность имеют штаммы RVА, которые являются одной из наиболее значимых причин острой обезвоживающей диареи. Штаммы RVA подвергаются генетическим перестройкам, точечным мутациям, реас-сортации и рекомбинации во всех 11 сегментах гена, что приводит к появлению большого количества генотипов. Их разнообразие является причиной мультисистемных заболеваний, что осложняет профилактику ротавирусной инфекции и выбор вакцины [7, 8].

Все ротавирусы имеют общий групповой антиген, который расположен во внутреннем капсиде вириона. Однако ротавирусы различных видов животных и человека имеют свой видоспецифический антиген, расположенный во внешней оболочке капсида [9, 10].

Геном ротавируса высоко вариабелен, что является причиной появления новых линий или сублиний внутри типов. Высокая степень генетической и антигенной вариативности у локально циркулирующих ротавирусов затрудняют понимание его глобального распространения и разработку эффективных методов защиты [11].

Высокий уровень заболеваемости обусловлен периодической сменой доминирующих G [P]-типов ротавируса группы А, генетическим и антигенным.

В настоящее время наиболее перспективным в создании вакцин против ротавирусной инфекции считается молекулярнобиологический подход с использованием рекомбинантных штаммов ротавируса животных и человека.

Стратегия конструирования вакцин строится на основе создания штаммов–реассортантов, содержащих как VP3, так и VP7 ротавирусов разных серотипов [12].

В связи с вышеизложенным с целью генетического контроля разрабатываемой вакцины необходимо иметь методику для индикации и идентификации ротавируса свиней, основанную на современных молекулярногенетических методах, таких как ОТ-ПЦР, ПЦР -ПДРФ, секвенирование и др.

Интенсивность цитопатического действия вирусов в перевиваемых культурах клеток оценивали в крестах. Оценка зависела от того, какая часть клеточного монослоя, по сравнению с контролем, была изменена ротавирусом (четыре креста - изменению подвергся весь монослой в пенициллиновой пробирке или на матрасике, три креста - изменена % монослоя, два креста - изменена ^ монослоя, один крест

• - изменена % монослоя).

Для определения наличия генетического материала ротавирусов применяли ОТ‑ПЦР с использованием амплификатора С1000 с оптическим блоком CFX96 (Био-Рад, США), специфических праймеров, наборов реагентов для постановки обратной транскрипции и ПЦР с интеркалирующими агентами (ЗАО «Синтол», г. Москва). Для проведения исследований предварительно выделили нуклеиновые кислоты ротавирусов методом преципитации с использованием набора «Рибо‑преп» ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Очищенную РНК вируса подвергли обратной транскрипцией в комплементарную дезоксирибонуклеиновую кислоту (кДНК) в присутствии специального фермента обратной транскрипции - ревертазы (ревертазу добавляли после предварительного нагрева до 95 C и охлаждения до 40 C) реакционной смеси. Образовавшуюся из РНК‑генома полную двухцепочечную кДНК подвергали многократным циклам амплификации с образованием целевых последовательных копий. Для фланкирования целевого участка гена VP6 генома ротавируса в первом раунде амплификации использовали внешние праймеры, с помощью которых обеспечили синтез фрагментов ДНК, содержащих внутри себя целевую последовательность. Во втором раунде амплифицировали специфичные фрагменты ДНК, используя продукты первого раунда в качестве матрицы и внутренние праймеры для запуска процесса амплификации. Для визуализации результатов амплификации использовали горизонтальный электрофорез в 1,8% агарозном геле, а также ПЦР с использованием интеркалирующего красителя Sybre Green. Количественный состав реакционной смеси для одного исследуемого образца составлял: 10-кратный ПЦР-буфер 1-5 мкл; 100 рМ каждого раствора прямого и обратного праймера - 0,1 мкл; 0,5 мкл - раствора обратной транскриптазы MMLV; неионизированная вода -14,3 мкл; матрица РНК/ДНК - 5 мкл. Общий объём реакционной среды - 25 мкл.

Гнездовая полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией на ген VP6 GARV выполнялась в следующей последовательности. До обратной транскрипции смесь праймеров и РНК инкубировали 1 минуту при 95 °С.

Первый раунд с наружными праймерами:

37 °C - 10 мин

95 °C - 5 мин

94 °C - 30 сек~

50 °C-30 сек ■

72 °C - 40 сек_

10 циклов

Второй раунд с внутренними праймерами:

60 C ^ 95 C - построение кривой плавле-

95 “С-5 мин94 °C - 30 сек'

56 °C-30 сек

72 °C-5 сек

40 циклов (сбор сигнала флуоресценции по каналу FAM)

ния (сбор сигнала флуоресценции по FAM).

Для определения гена VP4 программа амплификации имела вид: 37 °C - 10 мин, 95 °С -1 мин, (95 °С - 30 сек, 55 °С - 30 сек, 72 °С - 30 сек) – 40 циклов, 72 °С – 5 мин. Сбор сигнала флуоресценции осуществляли по каналу FAM.

Для определения гена VP7 программа амплификации имела вид: 37 C - 10 мин, 95 °С -1 мин, (95 °С - 10 сек, 54 °С - 10 сек, 72 °С - 30 сек) – 42 цикла, 72 °С – 5 мин. Сбор сигнала флуоресценции осуществляли по каналу FAM.

До обратной транскрипции смесь праймеров и РНК инкубировали 1 минуту при 95 °С.

Результаты и обсуждение. В начале исследований проведён поиск специфических генетических локусов, которые можно использовать для обнаружения ротавирусов свиней в исследуемом материале методом ПЦР. Среди свиней наиболее часто встречаются ротавирусы групп A, B, Н и C, причем группа A является наиболее изученной и распространенной [13]. Также известно, что ротавирусы внутри группы А классифицируются на основе строения двух поверхностных белков: VP7

(определяет G-генотип) и VP4 (определяет P-генотип), соответственно и гены, кодирующие эти белки можно использовать для генетической типизации ротавирусов свиней. Согласно проведённому обзору литературы наиболее распространенной комбинацией генотипов среди ротавирусов свиней группы A является G5P [14, 15]. Таким образом, правильно подобранные генетические локусы в качестве мишеней для ПЦР позволят успешно выполнить индикацию и типизацию возбудителя ротавирусной инфекции свиней.

Исходя из вышеизложенного, в качестве ДНК-мишеней для индикации и идентификации ротавируса свиней генетической группы А методом ПЦР предложены следующие три специфических участка генома возбудителя ротавирусной инфекции свиней - VP4, VP6 и VP7.

В программе Vector NTI 9.1 выполнен дизайн праймеров, использованных для индикации и типизации ротавируса свиней методом ПЦР, и которые представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Праймеры для обнаружения генома возбудителя ротавирусной инфекции свиней методом ПЦР

Название праймера	Целевой ген	Нуклеотидная последовательность 5 ’ ^ 3’	Локализация в гене	Размер апликона (bp)
F GARV VP6	VP6  (GB ID AB924099)	atggaggttctgtactcattgtca	22 - 45	1223
R GARV VP6		gatcggataccaggtagttagcc	1222 - 1244
Fn GARV VP6		ggaccagtatttccaccaggtatga	1093 - 1117	124
Rn GARV VP6		ctcacttaatcaacatgcttctaatgga	1189 - 1216
F GARV VP4	VP4  (GB ID PX677663)	atggcttcgctcatttatagaca	1 - 23	812
R GARV VP4		atrtctctattataytgcatytcyttcca	784 - 812
F GARV VP7	VP7  (GB ID JX498942)	atgtatggtattgaatataccacagttctaa	49 - 79	951
R GARV VP7		taatgaccgtgatcttttggaca	977 - 999

На рисунках 1-3 показаны расположения разработанных праймеров в целевых нуклеотидных последовательностях (участки генов VP6, VP4 и VP7 геномов ротавируса свиней). Следует отметить, что праймеры на ген VP6 разработаны под «гнездовую» ПЦР. В этом варианте амплификация выполняется в две стадии – сначала с «наружными» (F GARV VP6 и R GARV VP6), затем с «внутренними» или «гнездовыми» (Fn GARV VP6, Rn GARV VP6) праймерами. Это сделано для повышения чувствительности и специфичности ПЦР. Праймеры на гены VP7 и VP4 созданы для одностадийной ПЦР.

Рисунок 1 – Расположение праймеров для «гнездовой» ПЦР в фрагменте гена VP6 ротавируса A изолят «RVA pig CHN HB 04297 2023 G5P23I5» (GB ID AB924099)

Рисунок 2 – Расположение праймеров для ПЦР в фрагменте гена VP4 ротавируса свиней A штамм «RVA/HUN/Pig/142_11» ген VP4 (GB ID PX677663)

Рисунок 3 – Расположение праймеров для ПЦР в фрагменте гена VP7 ротавируса свиней A изолят «YA1011» ген VP7 (GB ID JX498942)

Проведённый BLASTn-анализ показал, что разработанные вышеперечисленные праймеры являются строго специфичными для целевых генетических локусов VP6, VP4 и VP7 генома ротавирусов свиней, так как идентичность и покрытие на целевые нуклеотидные последовательности у них находились в диапазоне от 95 до 100%.

Таким образом, чтобы обнаружить и идентифицировать ротавирусы свиней по генотипам в исследуемом патологическом материале предлагается следующий алгоритм постановки ОТ-ПЦР:

• 1    стадия – реакция обратной транскрипции с образцами выделенной РНК;

• 2    стадия – обнаружение генома ротавируса свиней генетической группы А с помощью «гнездовой» ПЦР с праймерами на ген VP6;

• 3    стадия – амплификация по гену VP4 и ПДРФ-анализ (или секвенирование по Сэнгеру);

• 4    стадия - амплификация по гену VP4 и ПДРФ-анализ (или секвенирование по Сэнгеру);

• 5    стадия – анализ и обработка полученных

результатов.

Далее была выполнена экспериментальная часть работы. От павших поросят до 10-12дневного возраста с признаками диареи из Республик Башкортостан и Татарстан в 10% раствор Хенкса были отобраны образцы органов и тканей – легкие, селезенка, лимфоузлы, тонкий отдел кишечника (с содержимым), печень, желудок, тимус, поджелудочная железа и др. Вирусные изоляты в течение 25 пассажей подвергались адаптации к клеткам перевиваемых линий SPEV и РК-15. Из двенадцати образцов, проявивших наиболее выраженное цитопати-ческое действие, выделена РНК, которая затем была преобразована в кДНК. Полученная кДНК амплифицирована с использованием комбинаций специфических праймеров, разработанных для ПЦР с генами ротавируса группы А - VP6, VP4 и VP7.

ПЦР-анализу были подвергнуты образцы: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 19, 23 и 27 (n=12). Для обнаружения генома ротавирусов по локусу VP6 использован гнездовой формат ПЦР с праймерами F GARV VP6, R GARV VP6, Fn GARV VP6 и Rn GARV VP6 с детекцией результатов с помощью горизонтального электрофореза в 1,8% агарозном геле. Для индикации по генам VP4 и VP7 использованы одностадийные ПЦР с использованием праймеров F GARV VP4, R GARV VP4, F GARV VP7 и R

GARV VP7 с фиксацией результатов путём построения кривой накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM.

Полученные результаты представлены на рисунках 4, 5 и 6, а также в таблице 2.

Рисунок 4 – Результаты 2 раунда «гнездовой» ПЦР на ген VP6. Примечание: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 19, 23 и 27 - исследуемые образцы, М - маркер молекулярного веса (100 - 1000 bp)

Рисунок 5 - ПЦР-анализ исследуемых РНК-образцов ротавируса по гену VP4 путём построения кривой накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM.

Примечания: ОКО - отрицательный контрольный образец, 1 - 12 - исследуемые образцы; 2а, 3а, 11а, 12а - образцы РНК, выделенные без добавления ингибиторов РНК-аз.

Рисунок 6 - ПЦР-анализ исследуемых РНК-образцов ротавируса по гену VP7 путём построения кривой накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM.

Примечания: ОКО - отрицательный контрольный образец, 1, 3 - 12 - исследуемые образцы

Таблица 2 - Результаты ПЦР по различным целевым генетическим локусам

Образец	Исследуемый материал	Используемая культура клеток	Ген VP6, ПЦР с ЭФ. детекцией	Ген VP4. ПЦР с исп. интрекалир. красителя (количество циклов, Ct)	Ген VP7, ПЦР с исп. интрекалир. красителя (количество циклов, Ct)
1	ткань легких поросенка из ООО «Башкирская мясная компания»	РК-15	+	24,5	19,5
2	ткань легких поросенка из ООО «Камский Бекон»	РК-15	+	24,0	н/о
3	ткань кишечника от поросенка из ООО «Камский Бекон»	РК-15	+	22,5	18.5
4	ткань  кишечника,  ООО «Камский Бекон»	РК-15	+	26,1	21,5
5	ткань легких поросенка, ООО «Камский Бекон»	РК-15	+	30,2	20,1
6	ткань легких поросенка, ООО «Камский Бекон»	РК-15	+	26,5	19,5
7	ткань легких поросенка, ООО «Башкирская мясная компания»	РК-15	+	28,9	22,0
8	ткань легких от поросенка из ООО «Башкирская мясная компания»	РК-15	+	32,3	22,5
9	ткань легких поросенка, ООО «Камский Бекон»	РК-15	+	29,1	22,7
10	ткань селезенки поросенка, ООО «Башкирская мясная компания»	SPEV	+	24,3	21,0
11	ткань кишечника поросенка, ООО «Камский Бекон»	РК-15	+	31,5	23,3
12	ткань селезенки поросенка, ООО «Камский Бекон»	SPEV	+	28,1	18,5

Из полученных результатов ПЦР следует, что во всех исследуемых образцах в клетках перевиваемых линий РК-15 и SPEV (кроме отрицательного контрольного образца (ОКО)) обнаружена вирусная рибонуклеиновая кислота возбудителя ротавируса свиней. Амплификация прошла успешно со всеми разработанными комбинациями праймеров к целевым локусам (VP4, VP6 и VP7) генома ротавируса свиней, кроме 2 исследуемого образца по гену VP7, что, по-видимому, связано влиянием на ПЦР различных ингибиторов, которые могут присутствовать в анализируемой пробе. Также можно предполагать, что наибольшее количество РНК-матрицы содержится в образце № 3 (ткань кишечника от поросенка, ООО «Камский Бекон»), так как в этом образце пороговый цикл (Ct), при котором проба считается положительной, составил 22,5 по гену VP4 и 18,5 по VP7 (наименьшее из всех полученных значений). Наименьшее количество РНК, по-видимому, содержится в образце № 8 (ткань легких от поросенка, ООО «Башкирская мясная компания») - в клетках РК-15, так как значение порогового цикла (Ct) в этом образце максимальное, как по гену VP4 - 32,3, так и по VP7 - 22,5. Также при выделении РНК из образцов, а также при постановке обратной транскрипции в исследуемый образец необходимо добавлять ингибитор РНК-аз, так данные энзимы ферментируют выделяемую РНК, снижая чувствительность метода. В этом можно убедиться на примере образцов 2а, 3а, 11а и 12а (рис. 5), в которые преднамеренно при выделении РНК и постановке обратной транскрипции не добавили ингибиторы РНК-аз. Наблюдаются торможение реакции, что проявляется более поздними пороговыми циклами.

Таким образом, адаптированные к животным клеткам с подтверждённой специфичностью по трём генетическим локусам (VP4, VP6 и VP7) методом ОТ-ПЦР вирусные изоляты использованы в качестве исходного материала при конструкции экспериментальных серий противовирусной вакцины.

Выводы. В результате поиска наиболее специфичных генетических локусов ротавируса свиней установлено, что наиболее специфичными генами являются гены VP4, VP6 и VP7, и их можно использовать для индикации и идентификации изучаемого возбудителя. Для каждого из них разработаны специфичные праймерные комбинации с программами постановки ОТ-ПЦР. Проведённый BLASTn-анализ доказал специфичность разработанных праймеров к геному ротавирусов свиней. На вирусных изолятах, адаптированных к клеткам SPEV и РК-15, доказана работоспособность разработанных праймерных комбинаций и программ постановки ОТ-ПЦР для каждого найденного генетического локуса генома ротавируса свиней.

От павших поросят с признаками инфекционной диареи до 10-12-дневного возраста из свиноводческих хозяйств Республик Башкортостан и Татарстан в 10% раствор Хенкса отобраны образцы органов и тканей. Вирусные изоляты в течение 25 пассажей подвергали адаптации к клеткам перевиваемых линий SPEV и РК-15. Двенадцать образцов с высоким инфекционным титром исследовали в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Результаты ОТ-ПЦР подтвердили наличие РНК-ротавируса свиней во всех исследованных образцах. Адаптированные к животным клеткам с подтверждённой специфичностью по трём генетическим локусам (VP4, VP6 и VP7) методом ОТ-ПЦР вирусные изоляты использованы в качестве исходного материала при конструкции экспериментальных серий противовирусной вакцины.