Заболеваемость коров маститом и свойства нового средства для его терапии

Производство экологически безопасных продуктов питания является одним из приоритетных направлений развития отечественной молочной перерабатывающей промышленности, что предусматривает получение исходного сырья высокого качества [7]. Однако острой остается проблема мастита в промышленном молочном скотоводстве, которой присущ мировой масштаб [3, 6]. В настоящее время к одной из быстро развивающихся областей современной нанотехнологии относится создание и применение в условиях производства наноразмерных частиц различных металлов [4]. Бактерицидные свойства молекул серебра характеризуются выраженным эффектом, как по отношению к аэробным, так и анаэробным микроорганизмам. При этом установлено, что патогенные микробы более чувствительны к молекулам серебра, чем непатогенные. Принцип его антимикробного воздействия заключается в том, что ионы данного метала, поглощаются клеткой микроорганизма, в результате чего нарушаются некото- рые физиологические функции клетки, включая размножение. Известно, что диапазон противомикробного действия серебра намного шире многих антибиотиков и сульфаниламидов [2]. Выбор нанокомпозитов серебра имеет преимущество перед многими существующими антимикробными средствами, поскольку ему не присуща проблема резистентности патогенных микроорганизмов [8]. Следовательно, молочное скотоводство является перспективным направлением в использовании наночастиц серебра в качестве антимикробного агента. Прежде всего, с позиции разработки на его основе новых фармакологических средств и включения их в состав комплексных схем терапии животных с воспалением вымени. Однако, предшествующим клиническому использованию испытуемого лекарственного средства, должна быть его оценка по биологической безопасности, которая устанавливается на этапе доклинических испытаний [1, 5].

Целью работы явились анализ заболеваемости коров маститом на предприя- тиях АПК Кировской области и изучение бактерицидных и токсических свойств у нового разработанного препарата на основе наночастиц серебра с протеолитическим ферментом.

Материал и методы исследований. Доклиническое исследование растворов с наносеребром выполнено в 2020 году в лаборатории болезней органов размножения и молочной железы Вятской ГСХА. Динамику маточного поголовья и формы проявления болезней молочной железы у коров осуществляли на основании статистической отчетности хозяйств Кировской области. В работе использовали серебросодержащие растворы (Ag) (2000 ррm) и Ag+глицерин (Gly), а также тест микроорганизмы E.coli и S.aureus. Их концентрация в испытуемых растворах при проведении опытов составила: 1х10⁹, 1х10⁸ и 1х10⁷ КОЕ/мл. Использовали в работе дискодиффузионный и суспензионный методы. При диско-диффузионном методе на плотную питательную среду в чашках Петри наносили культуры клеток E.coli и S.aureus, после чего на подсушенную поверхность питательной среды выкладывали квадраты из бязи, пропитанные исходными и в разведениях растворами Ag и Ag+Gly. После инкубирования чашек Петри, с посевами тест микроорганизмов, при температуре 37 ⁰С определяли наличие зон ингибирования их роста. При суспензионном методе тест микроорганизмы в тех же концентрациях вносили в пробирки с растворами исходными и в разведениях Ag и Ag+Gly [10].

Исследование комплексного препарата на острую и хроническую токсичность проведено на клинически здоровых половозрелых аутбредных белых мышах-самцах живой массой 20-24 г [9]. На первом этапе исследований, путем интраже-лудочного и внутрибрюшинного введения, была проведена оценка острой токсичности препарата. Для этого сформировали 4 группы мышей по 7 животных в каждой (2 подопытных и 2 контрольных). Комплектование групп осуществляли по принципу аналогов. Каждому животному подопытных групп, тем или иным способом, вводили изучаемый раствор в дозе 1,0 мл, контрольным – в идентичном количестве 0,9 % раствор натрия хлорида. После введения препарата за мышами осуществляли наблюдение на протяжении 2-х недель. В течение первых 6-ти часов лабораторные животные находились под непрерывным наблюдением. На втором этапе исследований провели токсикологическую оценку нового разработанного средства при его длительном применении. Для этого мышам подопытной группы (n=12) каждый день в течение 14-ти суток интрабрюшинно назначали в дозе 1,0 мл, животным контрольной группы (n=12) вводили физиологический раствор натрия хлорида в идентичной дозировке.

У лабораторных животных всех групп определяли массу до кормления перед началом эксперимента, на 1, 3, 7 и 14 сутки опыта. Уровень интоксикации организма определяли по изменениям клинической картины и смертности экспериментальных животных. Через две недели по окончании опыта выживших животных всех групп наркотизировали эфиром, проводили декапитацию и оценивали макрокартину изменений внутренних органов. При оценке токсичности препарата при длительном применении, часть мышей (n=6) подвергали эвтаназии через 24 часа после последней инъекции испытуемых растворов. От мышей получали кровь, стабилизировали ЭДТА и проводили гематологические исследования на анализаторе URIT-3020.

Цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики на достоверность различия сравниваемых показателей в программе Microsoft Excel с использованием критерия Стьюдента.

Результат исследований. Цифровой материал статистической отчетности за 2017, 2018 и 2019 гг. по распространенности воспаления вымени у коров на сельскохозяйственных предприятиях Кировской области представлен в таблице 1.

Из представленных данных таблицы 1 видно, что поголовье коров на сельскохозяйственных предприятиях с каждым годом увеличивается. Так в 2018 году численность коров составила 88664, что на 1,9 % больше по сравнению с предыдущим годом. В 2019 году коров насчитывалось уже 90610 или на 2,1 % больше, чем их было в 2018 году. Следует отметить, что за анализируемый период маточное поголовье увеличилось с 86960 до 90610 или на 4,0 %.

Таблица 1 – Динамика численности коров в сельскохозяйственных организациях предприятиях Кировской области и их заболеваемость воспалением молочной железы

Показатель	2017 г.	2018 г.	2019 г.
Количество подконтрольного поголовья коров	86960	88664	90610
Выявлено коров больных субклиническим маститом	26503	30498	32512
Выявлено коров больных клиническим маститом	18380	17268	18624

На фоне повышения численности коров отмечали и увеличение случаев заболеваемости их субклиническим маститом. В 2017 году данную патологию вымени диагностировали у 26503 коров (30,5 %), в 2018 году – у 30498 (34,4 %), в 2019 году – у 32512 (35,9 %). При этом с 18380 до 18624 (на 1,3 %) увеличилась численность больных клиническим маститом животных, но, тем не менее, общее количество коров с патологией вымени оставалось достаточно высоким и по годам наблюдения составило соответственно

44883 (51,6 %), 47766 (53,9 %) и 51136 (56,4 %). На следующем этапе научной работы провели блок микробиологических исследований. Было установлено, что исходные растворы Ag и Ag+Gly вызывают задержку роста бактерий тест-штаммов, а в разведениях – только под квадратами пропитанными испытуемыми средствами.

Суспензионный метод позволил провести количественное определение гибели бактерий тест-штаммов во времени. Результаты данных микробиологических исследований приведены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2 – Влияние серебросодержащих растворов и их разведений на выживаемость E.coli

Показатель	Количество жизнеспособных бактерий в серебросодержащих растворах и их разведениях (КОЕ/мл)
	Ag	Ag(1:10)	Ag(1:100)	Ag+Gly	Ag+Gly(1:10)	Ag+Gly (1:100)
До опыта	1х109	1х109	1х109	1х109	1х109	1х109
10 мин	1,5х104	1х108	1х108	1х108	1х108	1х108
20 мин	3000	1х108	1х108	1х108	1х108	1х108
30 мин	29	1х105	1х108	1х106	1х108	1х108
4 ч	0	180	112	0	96	1,1х108
24 ч	0	0	12	0	0	1х108
48 ч	0	0	0	0	0	1х108

Из представленных в таблице 2 данных по антибактериальной активности в отношении E.coli следует, что исходный раствор с содержанием частиц наносереб-ра уже через 30 мин снижает численность микроорганизмов до единичных клеток, а полностью вызывает их гибель через 4 ч. Следовательно, бактерицидные свойства нативного раствора начинают проявляться через 24 часа. Раствор в разведении 1:10 вызывает существенную нейтрализацию изучаемой культуры клеток микроорганизма уже через 4 ч, когда их концентрация снижается на 8 порядков. Полная гибель E.coli в этом случае проявлялась че- рез 24 ч, а бактерицидные свойства этого раствора были установлены через 48 часов. Раствор Ag в разведении 1:100 в первые 24 часа снижает на 8 порядков численность тест-микроорганизма, бактерицидные свойства при этом проявляются у данного раствора через 48 часов инкубации E.coli. Исходный раствор Ag+Gly бактериостатический эффект проявляет через 24 часа, а бактерицидный через 48 часов. Заслуживают внимания и антимикробные свойства Ag+Gly (1:10), которые через 24 часа справляются с нагрузкой в 108 и проявляют бактерицидные свойства в отношении E.coli спустя 48 часов после совместного культивирования. Результаты микробиологических исследований по влиянию Ag и

Ag+Gly на S.aureus в различных их разведениях представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Влияние серебросодержащих растворов и их разведений на устойчивость S.aureus

Показатель	Количество жизнеспособных бактерий в серебросодержащих растворах и их разведениях (КОЕ/мл)
	Ag	Ag(1:10)	Ag(1:100)	Ag+Gly	Ag+Gly(1:10)	Ag+Gly (1:100)
До опыта	1х109	1х109	1х109	1х109	1х109	1х109
10 мин	1,7х105	1,2х108	1,3х108	1,2х108	1,2х108	1х108
20 мин	12500	1х108	1,1х108	1х108	0,9 х108	1х108
30 мин	21	1х107	1х108	1х106	1х108	1х108
4 ч	0	380	1010	0	106	107
24 ч	0	0	18	0	Е. к.	1,6х107
48 ч	0	0	0	0	Е. к.	1,5х107

Результаты испытаний S.aureus в растворах Ag (таблица 3) показали, что исходный раствор Ag уже через 30 мин снижает численность S.aureus до единичных клеток, а его бактериостатический эффект проявляется через 4 ч. Раствор Ag в разведении 1:10 снижает исходную численность S.aureus на 8 порядков уже через 4 часа совместного инкубирования. Раствор Ag (1:100) подобные свойства проявляет через 24 часа. Исходный раствор Ag+Gly бактериостатический эффект проявляет через 4 часа инкубирования S.aureus Следует отметить, что растворы Ag, Ag (1:10), Ag+Gly через 48 часов проявляли бактерицидный эффект в отношении S.aureus при исходной концентрации 1х109. Разведения раствора Ag+Gly с шагом 10 обладали значительно меньшими антибактериальными свойствами в отношении S.aureus.

На следующем этапе провели оценку острой токсичности раствора с наносе-ребром и трипсином при внутрижелудоч-ном введении, которая показала, что в течение первых 10-15 минут после манипуляции, животные как подопытной, так и контрольной групп были незначительно угнетены, после чего у них возникал рефлекс умывания, а по истечению первого часа двигательная активность и аппетит у них полностью восстанавился. Изменения массы тела мышей в подопытной и контрольной группе не отражали достоверно значимой разницы. При однократном внутрибрюшинном введении препарата установили, что у мышей подопытной группы в течение первого часа отсутствовал аппетит, наблюдалось снижение двигательной активности, животные находились в сидячем положении сгорбившись, глаза были полузакрыты. У отдельных животных наблюдалась кратковременная одышка. У мышей контрольной группы была зарегистрирована идентичная картина. Динамика изменений массы тела животных в обеих группах не имела достоверного отличия, также не было зарегистрировано значительного падения массы тела у отдельных мышей. При наблюдении за лабораторными животными в течение двух недельного периода, после однократного введении исследуемого препарата, летального исхода не было зарегистрировано.

Результаты исследования крови от животных подопытной и контрольной группы не имели достоверных отличий.

Таким образом, однократное, как внутрижелудочное, так и внутрибрюшинное назначения в максимально разрешенном количестве для введения (1,0 мл) раствора с наносеребром, не вызывало гибели объекта исследования, что в пересчете составило 40000 мг/кг массы одной особи.

При длительном применении исследуемого средства, после каждой инъекции у подопытных животных наблюдалось кратковременное угнетение, и исчезновение аппетита в первые 30-60 минут, затем способность к движению восстанавливалась, и животные начинали поедать корм. Динамика изменений массы тела у животных подопытной и контрольной групп

(Таблица 4) не имела достоверного различия, однако у 2-х мышей, которым назначали испытуемое средство, и у одной, получавшей физиологический раствор натрия хлорида, через 7 суток, после начала эксперимента отмечали снижение массы тела более чем на 5 % от исходного значения.

Таблица 4 – Изменения массы тела мышей при многократном назначении раствора с наносе-ребром и трипсином

Показатель	Средняя масса животных		Количсетво мышей со снижением массы тела более чем на 5 %		Погибло мышей
	NaCl	Раствор с наносеребром	NaCl	Раствор с наносеребром	NaCl	Раствор с наносеребром
Исходная масса	21,5±0,5	22,3±0,6	-	-	-	-
Через 24 часа	21,5±0,5	22,3±0,6	0	0	0	0
Через 3-ое суток	21,4±0,4	22,2±0,6	0	0	0	0
Через 7 суток	21,3±0,4	22,1±0,6	1	2	0	0
Через 2 недели	21,4±0,3	22,3±0,7	0	0	0	1
Через 4 недели	22,2±0,3	23,4±0,5	0	0	0	0

По истечении 8-ми суток одна мышь подопытной группы отказалась потреблять корм и погибла, а масса оставшихся животных восстановилась до исходного значения. При вскрытии погибшего лабораторного животного установили покраснение и гиперемию органов брюшной полости, обширные кровоизлияния на брыжейке толстой кишки, что, по-видимому, явилось следствием механиче- ского воздействия иглы при процедуре инъекции. У мышей, подвергнутых эвтаназии через сутки и истечению 2-х недель после последней инъекции, макроскопических изменений внутренних органов установлено не было. Результаты исследования крови, полученной от лабораторных мышей, при определении хронической токсичности раствора с наносеребром и трипсином приведены в таблице 5.

Таблица 5 – Изменения гематологических показателей экспериментальных лабораторных животных при применении раствора с наносеребром в течение двух недель

Показатель	Через 24 часа		Через 14 суток
	физиологический раствор NaCl	раствор с наносеребром	физиологический раствор NaCl	раствор с наносеребром
Эритроциты, 1012/л	7,4±0,8	7,7±0,1	7,2±0,7	8,1±0,2
Средний объем эритроцитов, фл	55,0±1,2	58,7±1,1	54,1±1,1	55,9±1,7
Гемоглобин, г/л	78,0±3,6	86,8±2,8	74,2±9,4	85,3±1,3
Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг/мл	8,6±0,7	10,9±0,3*	9,8±0,7	10,5±0,2
Гематокрит, %	40,3±3,7	45,2±1,0	41,5±2,8	45,3±0,7
Показатель анизоцитоза эритроцитов, %	12,9±0,2	15,6±0,5**	13,3±0,4	13,2±0,5
Лейкоциты, 109/л	9,8±1,3	8,7±1,3	11,7±2,1	13,0±4,1
Тромбоциты, 109/л	548,0±126,3	769,2±45,6	639,6±138,8	722,5±128,9
Средний объем тромбоцита, фл.	5,7±0,2	6,2±0,2	5,9±0,2	5,3±0,2
Показатель анизоцитоза тромбоцитов, %	7,7±0,4	7,9±0,3	7,7±0,4	6,9±0,5

*Р < 0,05; **Р < 0,001 по отношению к контролю

Аналитическая оценка исследуемых показателей крови, показала, что у мышей подопытной группы через сутки после последней инъекции раствора с наносереб-ром и трипсином наблюдался более выраженный анизоцитоз эритроцитов – на 2,7 % (Р<0,001), а также была более высокой концентрация гемоглобина в эритроците на 2,3 пг/мл (Р<0,05). Морфологические показатели крови по окончанию эксперимента не имели достоверного отличия.

Заключение. Раствор наночастиц серебра (2000 ррm) и его разведение 1:10 проявляет бактерицидные свойства в отношении полевых штаммов микроорганизмов, вызывающих воспаление вымени у коров, через 30 минут, 48 часов при совместной инкубации и результат зависит от КОЕ/мл. На основании результатов токсикологических исследований комплексного препарата можно заключить, что переносимая доза данного лекарства составляет более 40000 мг/кг массы тела, что в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76 позволяет его отнести к 4 классу токсичности (более 5 000 мг/кг при введении в желудок). Применение раствора с наносеребром и трипсином на протяжении двух недель вызывает гиперхромию и анизоцитоз эритроцитов. При этом макроскопических изменений внутренних органов не происходит.

Резюме

В настоящее время проблемы воспаления вымени у коров и получение качественной молочной продукции не потеряли своей актуальности. При незначительном росте маточного поголовья продолжает оставаться высоким процент больных маститом животных в стаде. Разработана технология получения наночастиц серебра (2000 ррm). Микробиологические исследования показали, что нативные растворы Ag проявляют бактерицидные свойства к E.coli и S.aureus через 24 часа, а в разведении 1:10 через 48 часов. Разведения раствора Ag глицерином обладали значительно меньшими антибактериальными свойствами в отношении E.coli и S.aureus. В рамках доклинических исследований было установлено, что разовая доза (1,0 мл) раствора наносеребра и протеолитического фермента не вызывает летального исхода у лабораторных мышей. Применение препарата в течение двух недель вызывало у мышей гиперхромию и анизоцитоз эритроцитов, без каких-либо макроскопических изменений внутренних органов.