Закономерности влияния предварительной обработки корнеплодов моркови и свёклы столовой электромагнитными полями и биопрепаратами на устойчивость в процессе хранения

Стратегия технологического развития Российской Федерации выделяет в качестве актуальных такие направления, как переход к высокопродуктивному и экологически чистому агрохозяйству, разработка и внедрение систем рационального применения средств биологической защиты сельскохозяйственных растений и эффективное хранение полученной продукции. Учитывая также, что валовые сборы овощей и ягод на протяжении последних 10 лет растут [1] (при этом не более 40% собранной растениеводческой продукции может быть переработано или потреблено в период уборки урожая; остальная продукция подлежит краткосрочному или долго- срочному хранению), сохранение в межсезонный период товарного качества и пищевой ценности продукции растениеводства - актуальное направление как для прикладных, так и для фундаментальных исследований.

В связи с тем, что применение синтетических пестицидов, традиционно используемых для борьбы с заболеваниями растений, становится все более нежелательным по ряду причин, особый интерес представляют исследования, направленные на получение фундаментальных основ для разработки новых и усовершенствования существующих технологий хранения, в частности с использованием физических и биологических факторов, например, таких как электромагнитные поля крайне низких и сверх низких частот (ЭМП КНЧ/СНЧ) и биологические препараты [24].

Биопрепараты достаточно давно применяются для биологической защиты растений. Известно множество работ, подтверждающих их эффективность [5-9]. В настоящее время разработано множество различных биологических препаратов на базе новых штаммов микроорганизмов – антогонистов фитопатогенов, вызывающих микробиологическую порчу в процессе хранения.

Выбор ЭМП КНЧ/СНЧ для обработки растительного сырья обусловлен рядом факторов: современная наука считает факт воздействия ЭМП (в том числе КНЧ/СНЧ) на биологические объекты доказанным [10]; ЭМП КНЧ/СНЧ не вызывают нагревания тканей обрабатываемого материала (в отличие от высокочастотных); обработка сырья ЭМП КНЧ/СНЧ, с технологической точки зрения, обладает такими преимуществами, как экологичность и невысокая стоимость. Известен ряд работ, подтверждающих влияние ЭМП КНЧ/СНЧ на патогенные микроорганизмы [11-14]. Исследования, ранее проведённые в КНИ-ИХП – филиале ФГБНУ СКФНЦСВВ, показывают, что обработка ЭМП КНЧ позволяет повысить устойчивость некоторых овощей и фруктов при хранении [15, 16].

Необходимо также отметить, что одной из наиболее перспективных стратегий борьбы с заболеваниями растений в настоящее время является индукция естественной резистентности к фитопатогенам в растениях (в том числе во фруктах и овощах в послеуборочный период) за счёт биологического, химического или физического воздействия [17].

Данная стратегия основана на способности некоторых биологических агентов (таких как грибы или бактерии), химических веществ и видов физического воздействия (например, повышенная температура, пониженное давление, ультрафиолетовое излучение) активировать защитные механизмы в растениях.

Возникающие в растениях защитные ответы включают в себя различные элементы, в том числе накопление фенольных соединений, обладающих антимикробными свойствами, а также накопление связанных с патогенезом белков, к числу которых относятся разнообразные ферменты, принимающие участие в борьбе растения с фитопатогенами.

Из научно-исследовательской литературы известно, что индукция резистентности может сопровождаться повышенным накоплением таких ферментов, как пероксидаза, хитиназа, β-1,3-глюканаза, фенилала-нин-аммиак-лиаза, каталаза и др. [18].

Таким образом, при изучении различных способов обработки растительного сырья, призванных повысить его устойчивость в процессе хранения, представляет интерес исследовать также изменение активности защитных ферментов и содержания фенольных веществ.

Целью исследования являлось выявление закономерностей влияния предварительной обработки корнеплодов моркови и свёклы столовой электромагнитными полями крайне низкой и сверх низкой частоты и биопрепаратами на устойчивость к микробиологической порче в процессе хранения.

Объекты и методы исследований. На учные исследования проведены с использованием «Методических указаний по организации и проведению НИР» (2013 г.).

Экспериментальные исследования проводились в четырехкратной повторности. Математическую обработку экспериментальных данных проводили методом описательной статистики и дисперсионного анализа, используя пакеты программ Microsoft Excel и Statistica. Статистическую значимость оценивали на уровне Р = 0,05.

В процессе исследования влияния различных способов обработки на фитопатогены в опытах in vitro и in vivo в качестве объектов исследования использовали:

– фитопатогены, выделеные из пораженных корнеплодов овощей: Erwinia carotovora, Sclerotinia sclerotiorum, Alternaria radicina, Botrytis cinerea, Rhizoctonia scolani;

– биопрепараты: Экстрасол, Алирин, Бактофит, Витаплан, Гамаир;

– корнеплоды: морковь столовую сорта Абако, свёклу столовую сорта Ронда.

В процессе исследования влияния способов обработки на активность фермента пероксидаза в процессе хранения объектами исследования являлись корнеплоды моркови столовой сорта Шантенэ 2461.

Для исследования влияния ЭМП КНЧ/СНЧ использовали лабораторную экспериментальную установку (рис. 1), состоящую из универсального генератора сигналов RIGOL DG1022, усилителя MMF LV102, осциллографа LeCroy WA202 и соленоида (длина – 802 мм, диаметр – 204 мм, 533 витка на 1 ряд).

Рис. 1. Экспериментальная установка для обработки электромагнитными полями

Микробиологические исследования выполнены в соответствии с ГОСТ 319042012, ГОСТ 26669-85, ГОСТ 10444.15-94, ГОСТ 10444.12-2013.

Грибковые фитопатогены были выделены из пораженных корнеплодов овощей и культивированы на среде Сабуро при (+27±1) °С в течение 14 суток. Споры фи-топатогенных грибов были получены путем промывания выращенных культур плесневых грибов стерильной дистиллированной водой, содержащей 0,05% Твин-80. Суспензии фильтровали через три слоя стерилизованной марли и доводили до концентрации 1×105 – 1×107 спор/мл. Учет количества спор производили с помощью камеры Горяева.

Возбудитель мокрой бактериальной гнили Erwinia carotovora был выделен из пораженных корнеплодов моркови столовой и культивировался в дальнейшем на среде питательный агар или питательный бульон с глюкозой (в зависимости от целей использования) при температуре (+30±1) °С в течение 48 часов. Титр выра- щенной культуры определяли методом высева разведений.

Исследования in vitro антагонистических свойств биопрепаратов в отношении фитопатогенов осуществляли методом агаровых блоков.

Исследуемые биопрепараты культивировали на среде, приготовленной из сухого питательного агара с добавлением 1% глюкозы. Для подготовки агаровых блоков посевной материал выращивали в течение 48-72 часов при температуре (+30±1) °С.

Для исследования влияния биопрепаратов на заболеваемость и диаметр поражения заболеваний, вызванных фитопатогенами в зависимости от температуры хранения, на корнеплодах овощей стерильной иглой делали проколы и вносили суспензию биопрепарата дозировкой 10 мкл. Для контрольных образцов использовали стерильную дистиллированную воду. В этот же прокол вносили 10 мкл подготовленной суспензии фитопатогенов. Корнеплоды овощей помещали в закрытые прозрачные пластиковые контейнеры, туда же поме- щали ёмкость с жидкостью для обеспечения влажности и хранили при температурах +(2±1) °C и +(25±1) °C. Диагностику заболеваемости и размер характерных поражений, вызванных фитопатогенами на корнеплодах при температуре +(25±1) °C проводили через 7 суток, а при температуре +(2±1) °C – через 7, 14 и 28 суток для моркови столовой и через 7, 14, 28 и 35 суток для свеклы столовой.

Изучение активности пероксидазы проводили спектрофотометрическим методом с использованием гваякола в качестве субстрата. При этом определяли увеличение в поглощении при 460 нм в течение 120 с после добавления перекиси водорода в реакционную смесь. Активность фермента выражали в относительных единицах на 1 г сухой массы за 1 минуту.

Обсуждение результатов. Для исследований был выбран ряд биопрепаратов на основе бактерий Bacillus subtilis: «Экстрасол», «Витаплан», «Гамаир», «Бактофит» и «Алирин». Их выбор был сделан на основании исследований рынка, с учётом технологических и биоконтрольных свойств, в том числе с учётом потенциальной способности воздействовать на фитопатогены, являющиеся основными причинами заболеваемости корнеплодов свёклы и моркови столовых, подлежащих хранению на Юге России (Sclerotinia sclerotiorum, Alternaria radicina, Erwinia сarotovora, Botrytis cinerea, Rhizoctonia scolani).

Антагонистические свойства выбранных биопрепаратов по отношению к фитопатогенам, вызывающим заболевания корнеплодов овощей, были подтверждены в опытах in vitro. Полученные результаты представлены на рисунке 2.

Рис. 2. Антагонистическая активность биопрепаратов по отношению к фитопатогенам корнеплодов

В частности было установлено, что биопрепарат «Витаплан» наиболее эффективен по отношению к фитопатогенам, вызывающим заболевания моркови столовой, а биопрепарат «Бактофит» наиболее эффективен по отношению к фитопатогенам, вызывающим заболевания свёклы столовой.

Так, обработка биопрепаратом «Вита-план», снижает степень поражения и развития заболеваний корнеплодов моркови, вызванных Alternaria radicina и Erwinia carotovora, при температуре +25 °C на 38,0 и 9,7%, а при температуре +2 °C на 35,2 и

25,0%, соответственно. Обработка биопрепаратом «Бактофит», снижает степень поражения и развития заболеваний корнеплодов свёклы столовой, вызванных Sclerotinia sclerotiorum и Botrytis cinerea, при температуре +25 °C на 40,0 и 58,0%, а при температуре +2 °C на 50,0 и 33,8%, соответственно.

В таблице 1 представлены результаты влияния обработки корнеплодов свёклы столовой биопрепаратом «Бактофит» на диаметр поражения, вызываемого Botry-tis cinerea, в зависимости от условий хранения.

Таблица 1. Влияние биопрепарата «Бактофит» на диаметр поражения, вызываемого Bo- trytis cinerea, на корнеплодах свёклы столовой в зависимости от условий хранения

Продолжительность хранения, сутки	Botrytis cinerea и Bacillus subtilis	Botrytis cinerea (контроль)
температура хранения 2 °С
7	0,0	2,0±0,7
14	1,5±0,6	3,8±0,7
28	2,2±0,6	4,5±0,7
35	3±0,6	6±0,7
температура хранения 25 °С
7	2,2±0,6	4,5±0,7
14	4,5±0,6	7,5±0,7

На следующем этапе работы исследовали влияние обработки ЭМП КНЧ на устойчивость корнеплодов в процессе хранения. В опытах in vitro установлено, что обработка ЭМП КНЧ оказывает ингибирующие действие на развитие таких фито-патогенных микроорганизмов, как Sclerotinia sclerotiorum, Alternaria radicina и Erwinia carotovora.

В таблице 2 представлены результаты изучения влияние обработки ЭМП КНЧ на диаметр поражения, вызываемого фитопа- тогенами на корнеплодах моркови и свёклы столовой в зависимости от условий хранения. Наибольшая эффективность угнетения установлена при обработке ЭМП КНЧ со следующими параметрами: для Sclerotinia sclerotiorum и Alternaria radicina: частота – 28 Гц, продолжительность обработки – 15 минут, магнитная индукция в 12 мТл; для Erwinia carotovora: частота – 28 Гц, продолжительность 15 минут магнитная индукция в 9 мТл.

Таблица 2. Влияние обработки ЭМП КНЧ на диаметр поражения, вызываемого фитопа- тогенами на корнеплодах моркови и свёклы столовой в зависимости от условий хранения

Сырьё: фитопатоген + обработка	Температура хранения и продолжительность
	2 °С, 20 суток	25 °С, 10 суток
	Диаметр поражения, мм
Морковь столовая: Erwinia carotovora+ЭМП КНЧ	2,1±0,8	3,3±0,8
Морковь столовая: Erwinia carotovora+без обработки	3,5±2	7,5±2
Свёкла столовая: Sclerotinia sclerotiorum+ЭМП КНЧ	2,0±0,5	3,0±0,5
Свёкла столовая: Sclerotinia sclerotiorum+без обработки	3,2±1,2	5,6±1,2

На следующем этапе работы исследовали влияние комплексной (последовательной) обработки ЭМП КНЧ и биопрепаратами на устойчивость корнеплодов в про- цессе хранения. В результате установлена эффективность комплексной обработки по отношению к фитопатогенам корнеплодов моркови и свёклы столовой (рис. 3, 4).

■ Контроль

■ Обработка

Рис. 3. Влияние последовательной обработки корнеплодов моркови столовой ЭМП КНЧ и биопрепаратом «Витаплан» на развитие фитопатогенов в процессе хранения в течение 15

суток при +2°С

■ Контроль

■ Обработка

Рис. 4. Влияние последовательной обработки корнеплодов свёклы столовой ЭМП КНЧ и биопрепаратом «Бактофит» на развитие фитопатогенов в процессе хранения в течение 15 суток при +2°С

Также было установлено, что для корнеплодов моркови столовой параметры комплексной обработки, обеспечивающие максимальное снижение количества бактериальной микрофлоры (МАФАнМ) и плесневых грибов, составляют: ЭМП КНЧ – частота 28 Гц, время обработки 5 минут, индукция 12 мТл; биопрепарат «Вита-план» – концентрация 108 КОЕ/г, расход 13-15 мл/кг. Соответствующие параметры для корнеплодов свёклы столовой: ЭМП КНЧ – частота 15 Гц, время обработки 5

минут, частота 24 Гц, время обработки 5 минут, частота 30 Гц, время обработки 5 минут, индукция 9 мТл; биопрепарат «Бактафит» – концентрация 108 КОЕ/г, расход 13-15 мл/кг.

Таким образом, установлено, что комплексная обработка корнеплодов свёклы столовой и моркови столовой по сравнению с контрольными образцами обеспечивает снижение потерь и стабилизацию показателей качества в процессе хранения.

На последнем этапе работы исследовали влияние обработки ЭМП СНЧ (35 Гц, 12,5 мТл, 30 мин) и биопрепаратом «БСка-3» (2%-ный водный раствор) на активность пероксидазы в корнеплодах моркови столовой (рис. 5). Обработанные корнеплоды хранили в течение 5 недель в холодильной камере при температуре 2±1°С и влажности 75±2%.

Из представленных на рисунке 5 данных следует, что обработка корнеплодов моркови столовой ЭМП СНЧ приводит по сравнению с контролем к увеличению активности пероксидазы через 1 неделю хранения и к снижению через 3 недели и далее. Обработка корнеплодов моркови столовой биопрепаратом «БСка-3» приводит по сравнению с контролем к значительному снижению активности пероксидазы через 1 неделю хранения и к увеличению через 3 недели с последующим снижением.

Недели

—•—Контроль -■- ЭМП —*— БСКа

Рис. 5. Влияние обработки корнеплодов моркови столовой ЭМП СНЧ и биопрепаратом «БСка-3» на активность пероксидазы в процессе хранения

Выводы. Таким образом, в опытах in vivo и in vitro установлены закономерности влияния электромагнитных полей КНЧ и биопрепаратов (раздельно и в комплексе) на патогенные микроорганизмы, вызывающие заболеваемость корнеплодов моркови и свёклы столовой.

Установлено следующее:

– биопрепарат «Витаплан» наиболее эффективен по отношению к фитопатогенам, вызывающим заболевания моркови, а биопрепарат «Бактофит» наиболее эффективен по отношению к фитопатогенам, вызывающим заболевания свёклы;

– обработка биопрепаратом «Бактофит» приводит к уменьшению диаметра поражения вызываемого Botrytis cinerea на корнеплодах свёклы столовой как при температуре хранения 2 °С, так и 25 °С;

– обработка ЭМП КНЧ (для свёклы столовой частота – 28 Гц, продолжительность обработки – 15 минут, магнитная индукция в 12 мТл; для моркови столовой часто- та – 28 Гц, продолжительность 15 минут магнитная индукция в 9 мТл) приводит к уменьшению диаметра поражения фитопатогенами как при температуре хранения 2 °С, так и 25 °С;

– применение последовательной обработки (для моркови столовой: ЭМП КНЧ – частота 28 Гц, время обработки 5 минут, индукция 12 мТл; биопрепарат «Вита-план» – концентрация 108 КОЕ/г, расход 13-15 мл/кг; для корнеплодов свёклы столовой: ЭМП КНЧ – частота 15 Гц, время обработки 5 минут, частота 24 Гц, время обработки 5 минут, частота 30 Гц, время обработки 5 минут, индукция 9 мТл; биопрепарат «Бактафит» – концентрация 108 КОЕ/г, расход 13-15 мл/кг.) в наибольшей степени приводит к снижению количества пораженных корнеплодов;

– активность пероксидазы в корнеплодах моркови столовой изменяется по-разному в зависимости от способа и обработки перед закладкой на хранение.