Закономерности взаимодействия бычьего сывороточного альбумина с дифильными молекулами

Сывороточные альбумины обладают уникальной способностью к избирательному связыванию гидрофобных веществ, например жирных кислот, липидов, билирубина, аминокислот [1, 2]. Процессы ассоциации сывороточного альбумина с ПАВ используются при разработке продуктов питания и новых лекарственных веществ, а также при селективной экстракции и очистке белка [3].

В многочисленных исследованиях взаимодействия глобулярных белков, особенно бычьего сывороточного альбумина (БСА), с ионными и неионными ПАВ [4-12] показано, что ПАВ взаимодействуют с БСА с образованием ассоциатов (комплексов) переменного состава, при этом наблюдаются существенные конформационные изменения вторичной структуры белка – доля спиральных a -цепей уменьшается [4, 5, 9, 11, 13], а термическая устойчивость вторичной структуры возрастает [7, 14]. БСА связывает либо индивидуальные молекулы ПАВ, либо образуются мицеллоподобные агрегаты (кластеры) ПАВ [4,5, 8, 10, 15]. При низких концентрациях ПАВ взаимодействие имеет электростатическую природу за счет связывания ионов ПАВ противоположно заряженными группами белка. При высоких концентрациях (в области критической концентрации ми-целлообразования (ККМ) и выше) число связанных молекул ПАВ резко возрастает в результате кооперативности процесса, определяющую роль при этом играют гидрофобные взаимодействия [6, 9, 12, 13, 16-19]. В этом случае мицеллы ПАВ формируются в различных точках частично развернутой полипептидной цепи белка. Размеры связанных агрегатов увеличиваются с ростом концентрации ПАВ вплоть до насыщения белка, причем их размер всегда меньше по сравнению с мицеллами в отсутствие БСА [5, 10, 20].

Целью данной работы является выяснение роли структурных особенностей макромолекулы БСА при связывании катионных ПАВ в смешанных растворах в широком диапазоне концентраций

ПАВ и молярного соотношения компонентов ПАВ/БСА. В работе использовали флуоресцентный метод, который успешно применяется для подобных исследований [11-13, 21-25]. БСА, как и многие белки, содержит флуорофоры: два триптофана ( Trp ¹³⁵, Trp ²¹⁴). Триптофан весьма чувствителен к полярности окружения, и спектры флуоресценции могут дать существенную информацию о процессе связывания молекул ПАВ и конформационных изменениях белка.

Материалы и методы

Бычий сывороточный альбумин (БСА) производства « Sigma», глобулярный белок, содержание белка 97 % , молярная масса 6,7∙10⁴ Da, изоэлектрическая точка 4,9. Катионные ПАВ: октаде-кенилдигидроксоэтилметиламмоний хлорид (ОДМАХ) (С 23 Н 48 О 2 NCI), KKМ 1,5 ⋅ 10^-4 М, хроматографически чистый, цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) (С 19 Н 42 NBr), ККМ 8 ⋅ 10^-4 М, производства « Sigma».

Для приготовления растворов БСА, ПАВ и их смесей использовали бидистиллят с удельной электрической проводимостью (22 ^оС) 6,7 ⋅ 10^-6 Ом^-1 м^-1. Смеси белка с ПАВ получали смешением исходных растворов компонентов. Концентрацию БСА в исследуемых смесях варьировали от 5∙10^-6 до 2∙10^-5 М. Концентрацию ПАВ варьировали в широком диапазоне до и после ККМ. рН растворов смесей БСА и ПАВ устанавливали равным 5,8.

Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по оптической плотности растворов при длине волны 280 нм, используя молярный коэффициент поглощения для БСА 44720 М-1см-1 [24]. Измерения стационарной флуоресценции проводили с применением спектрофлуоримет-ра «Элюмин-2М». Длина волны возбуждения составляла 280 нм. Время жизни флуоресценции определяли из кинетики флуоресценции, измеренной с помощью наносекундного спектрометра «SP-70».

Результаты и их обсуждение

На рисунке 1 представлены зависимости относительной интенсивности флуоресценции БСА I / I 0 (где I 0 , I – интенсивность флуоресценции в отсутствие и в присутствии тушителя соответственно) от концентрации ПАВ при постоянной концентрации белка в растворе C БСА =2 ⋅ 10^-5 М. Как видно из рисунка 1, относительная интенсивность флуоресценции резко уменьшается в определенном диапазоне концентраций ПАВ, что свидетельствует о сильном тушении флуоресценции БСА при введении катионных ПАВ.

Можно выделить 3 участка, характерных для обоих катионных ПАВ. В области низких концентраций ЦТАБ (рис. 1а) интенсивность флуоресценции уменьшается с ростом концентрации ПАВ. При концентрации ЦТАБ, равной 6 ⋅ 10^-4 М, что соответствует соотношению 30 молекул ЦТАБ на одну молекулу белка, интенсивность флуоресценции достигает наименьшего значения и составляет 26% от исходного значения интенсивности. Далее с увеличением концентрации ЦТАБ интенсивность флуоресценции растет и при 5 ⋅ 10^-3 М ЦТАБ составляет 40% от исходного значения I 0 , соотношение компонентов при этом равно 250 молекул ПАВ на молекулу белка. При дальнейшем увеличении концентрации ЦТАБ относительная интенсивность флуоресценции не меняется.

_1,1 I / I0

1•

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

(а)

_1,1 I / I0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

1∙10-8    1∙10-7    1∙10-6     1∙10-5    1∙10-4    1∙10-3     1∙10-2

(б)

0,2

1∙10-8    1∙10-7    1∙10-6      1∙10-5     1∙10-4     1∙10-3     1∙10-2

CЦТАВ, М

CОДМАХ, М

Рис. 1. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции БСА от концентрации добавленного в раствор белка катионного ПАВ: ЦТАБ (а) и ОДМАХ (б), С БСА = 2 ⋅ 10^-5 М, рН= 5.8, Т=293К

Аналогичная зависимость получена и при введении катионного ПАВ ОДМАХ (рис. 1б). Первоначально с ростом концентрации ОДМАХ интенсивность флуоресценции уменьшается, достигая наименьшего значения при 5 - 10^-4 М ОДМАХ, при этом она составляет 32% от исходной интенсивности флуоресценции БСА, что соответствует 25 молекулам ПАВ на одну молекулу БСА. С увеличением концентрации ОДМАХ до 1 - 10^-3 М интенсивность флуоресценции несколько увеличивается, достигая 38% от I 0 , что соответствует 50 молекулам ОДМАХ на молекулу белка, и далее остается постоянной. Необходимо отметить, что максимальное тушение флуоресценции в обоих случаях при введении ЦТАБ и ОДМАХ наблюдается при концентрациях катионных ПАВ в области ККМ.

Тушение флуоресценции может протекать по механизму динамического или статического тушения [25]. В обоих случаях зависимость относительной интенсивности от концентрации тушителя описывается уравнением Штерна-Фольмера (1):

I o /I = 1 + k q T o [Q, I o /I = 1 + K sv [Q], (1) где I₀ , I - интенсивность флуоресценции флуорофора в отсутствие и в присутствии тушителя соответственно; k_q - константа скорости реакции тушения; т₀ - истинное время жизни флуоресценции (в отсутствие тушителя); [ Q ] - концентрация тушителя; K SV - константа Штерна-Фольмера (константа тушения).

Тушение происходит в результате образования в основном состоянии нефлуоресцирующего комплекса белок-ионное ПАВ. Если спектр поглощения такого комплекса близок к спектру поглощения белка, то возбуждающий свет будет поглощаться как свободными, так и связанными в комплекс молекулами БСА, а флуоресцировать будут лишь свободные молекулы БСА. При тушении по статическому механизму константа Штерна-Фольмера представляет собой константу равновесия образования комплекса в основном состоянии [26].

Полученные экспериментальные данные в области низких концентраций катионных ПАВ (см. рис. 1) проанализированы в рамках уравнения Штерна-Фольмера (1) (рис. 2 и табл. 1).

Линейный характер зависимости интенсивности флуоресценции БСА от концентрации ПАВ свидетельствует об образовании комплекса БСА-катионное ПАВ. Константы комплексообразования, вычисленные по уравнению (1), для обоих ПАВ близки и равны (4,7 ± 0,2) - 10³ М ' ¹ для ЦТАБ и (4,3 ± 0,4) - 10³ М^-1 для ОДМАХ (см. табл. 1). Истинное время жизни флуоресценции БСА т₀ равно 3.9 - 10^-9 с и не зависит от концентрации ПАВ, что свидетельствует о статическом тушении. Эти данные совпадают с литературными данными [12, 21]. В работе [21] при измерении времени жизни флуоресценции БСА в присутствии додецилсульфата натрия показано, что тушение флуоресценции протекает преимущественно по механизму статического тушения и обусловлено появлением молекул ионных ПАВ в ближайшем окружении триптофановой группы Trp ¹³⁵. Для определения значимости механизма статического тушения в работе [23] построена зависимость ln ( I 0 /I) от числа связанных молекул цетилпиридиний хлорида. Полученная линейная зависимость позволила авторам сделать вывод о преимущественно статическом тушении флуоресценции БСА катионным ПАВ.

Рис. 2. Тушение флуоресценции БСА катионными ПАВ: ЦТАБ (а) и ОДМАХ (б), С бса = 2 - 10^-5 М, рН =5.8, Т=293К

На рисунке 3 приведены спектры флуоресценции БСА и комплексов БСА-ЦТАБ. Длина волны максимума флуоресценции БСА без ПАВ Х _м=340 нм. В области низких концентраций ПАВ образование комплексов (в диапазоне молярных соотношений ПАВ/белок от 2,5 до 30 моль

ЦТАБ/моль БСА) сопровождается постепенным сдвигом длины волны максимума флуоресценции в коротковолновую область и уменьшением интенсивности флуоресценции. Максимальный сдвиг на 8 нм ( λ м =332 нм) наблюдается при образовании комплексов БСА-ЦТАБ с молярным соотношением 30 моль ЦТАБ/моль БСА, что соответствует минимальному значению I/I 0 (рис. 1 а). Далее при увеличении соотношений компонентов в области высоких концентраций ПАВ длина волны максимума флуоресценции остается практически постоянной.

Таблица 1

Параметры связывания цетилтриметиламмоний хлорида (ЦТАБ), октадекенилдигидроксоэтилметиламмоний хлорида (ОДМАХ) и цетилтриметиламмоний хлоридом (ЦТАХ) бычьим сывороточным альбумином (БСА), рассчитанные по уравнению Штерна – Фольмера и по изотермам связывания, рН 5,8, Т=293К

ПАВ	K SV ⋅ 10-3, М-1	n	n н	K ⋅ 10-3, М-1
ЦТАБ	4.7 ± 0.2	75 ± 3	1.57 ± 0.01	1.2 ± 0.1
ОДМАХ	4.3 ± 0.4	70 ± 26	1.38 ± 0.06	1.2 ± 0.4
ЦТАХ*	8.9 ± 0.1	133 ± 20	1.91 ± 0.02	4.0 ± 0.4

* – данные работы [11].

Сдвиг максимума спектра флуоресценции комплексов БСА-ОДМАХ равен 4 нм и соответствует образованию комплексов при соотношении 25-50 моль ОДМАХ/моль БСА (рис. 1 б). Необходимо отметить, что присутствие ПАВ приводит к сдвигу длины волны максимума спектров поглощения на 1-3 нм в коротковолновую область.

Рис. 3. Спектры флуоресценции БСА при различных концентрациях ЦТАБ, добавленного в раствор белка. С БСА = 2 ⋅ 10^-5 М, С ЦТАБ ⋅ 10⁴, М: 0(1), 0.1(2), 0.3(3), 1(4), 3(5), 5(6), 7(7), рН = 5.8, Т=293К

Полученные данные согласуются с результатами работ [11, 21, 27], в которых изучено взаимодействие БСА с додецилсульфатом натрия и цетилтриметиламмоний хлоридом и высказано предположение о существовании в растворе трех равновесных форм белка: собственно белок, комплекс белок-ПАВ и «частично денатурированный» белок. Использование кругового дихроизма показало уменьшение доли a –спиралей во вторичной структуре белка при ассоциации с ПАВ при больших концентрациях [11, 12]. Количественное соотношение между равновесными формами зависит от концентрации ионного ПАВ.

Экспериментальные данные по тушению флуоресценции БСА катионными ПАВ (см. рис. 1) позволяют рассчитать число ν (моль ПАВ/моль БСА) молекул ПАВ, связанных одной молекулой белка при разных молярных соотношениях компонентов в растворе. В области низких концентраций при С ЦТАБ < 6 ⋅ 10^-4 М и С ОДМАХ <  5 ⋅ 10^-4 число связанных молекул рассчитывали по формуле:

ν = a C _S / C _P ; (2)

a = ( I - I ₀)/( I _min - I ₀) или a = ₍ I - _{1) /(} ^I min - ₁₎ , (3) I 0 I 0

где a – степень связывания ПАВ белком; С S , С Р – общая концентрация ПАВ и белка, соответственно; I 0 , I и I min – интенсивность флуоресценции БСА, смесей БСА с ПАВ при различных концентрациях ПАВ и минимальная интенсивность.

На рисунке 4 приведены изотермы связывания катионных (зависимость среднего числа молекул ПАВ, связанных одной молекулой БСА) в области низких концентраций ПАВ. В соответствии с [28, 29] образование комплексов белок-ПАВ переменного состава может быть представлено в виде ступенчатого равновесного процесса присоединения молекулы ПАВ (S) к макромолекуле белка (P), уже имеющей некоторое количество связанных молекул ПАВ.

Каждое из этих превращений характеризуется соответствующей константой равновесия. Константы комплексообразования каждой стадии в общем случае не равны, поскольку процесс связывания следующей молекулы зависит от числа уже присоединенных к белку молекул ПАВ.

Рис. 4. Изотермы связывания ЦТАБ (а) и ОДМАХ (б) БСА при низких концентрациях катионных ПАВ.

На графиках: точки - экспериментальные данные, линии - обработка экспериментальных данных по уравнению (4), рН 5,8, Т=293К

С учетом кооперативности процесса число v молекул ПАВ, связанных макромолекулой белка, в зависимости от концентрации ПАВ может быть выражено следующим уравнением (4) [28, 29]:

_v = n ( K [ S ]) ⁿ н ,                                               (4)

1 + ( K [ S ]) ⁿ н где n - число связанных лигандов (ПАВ); K - константа связывания ПАВ белком; п_н - коэффициент кооперативности; [ S ] - концентрация лиганда (ПАВ). Параметры связывания ЦТАБ и ОДМАХ сывороточным альбумином представлены в таблице 1. Интересно отметить, что число n связанных в комплекс молекул катионного ПАВ приблизительно равно числу анионных групп макромолекулы белка. Сумма аминокислотных остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот в БСА равна 100 [24].

Для сравнения в таблице 1 приведены константы образования комплекса БСА с цетилтриметиламмоний хлоридом (ЦТАХ) при рН 7.0 [11]. Константы для всех катионных ПАВ примерно одинаковы, более высокие значения K_SV и K для ЦТАХ можно объяснить величиной рН. Депротонирование кислотных групп БСА при увеличении рН (от 5,8 до 7,0) приводит к конформационным изменениям белка, что способствует доступности молекул ПАВ к гидрофобным областям связывания, электростатические взаимодействия также увеличиваются. Соответственно коэффициент кооперативности и число связанных молекул в случае ЦТАХ выше аналогичных параметров для ЦТАБ и ОДМАХ при меньшем значении рН.

Рассмотрим влияние концентрации БСА на флуоресцентные характеристики его смесей с ЦТАБ. На рисунке 5 приведены зависимости относительной интенсивности флуоресценции от концентрации ЦТАБ при различных концентрациях БСА. Видно, что с увеличением концентрации белка необходима более высокая концентрация ПАВ, чтобы достичь одинакового уменьшения интенсивности флуоресценции (одинакового значения I / 1 0 ).

Полученные данные позволяют провести количественную оценку процесса связывания поверхностно-активного вещества белком способом, предложенным в работе [22]. Процесс связывания описывается суммарным упрощенным равновесием ( S - ПАВ, БСА - белок) S + БСА о- EGAS. Константа равновесия (эффективная константа связывания) равна (5):

K b = [ EGAS ]/{[ S ][ БСА ]} .                                (5)

При низких концентрациях ПАВ (до насыщения белка) равновесная концентрация комплекса в уравнении (5) равна концентрации связанного ПАВ ([EGAS]=[S]связ.), а равновесная концентра- ция белка равна концентрации белка в растворе. С учетом того, что [S]связ./[БСА] равно числу молекул, связанных одной молекулой БСА, последнее уравнение преобразуется в (6):

K b = V /[ S ] своб. ,                                                (6)

где V - число молекул ПАВ, связанных одной молекулой белка, [ S ] _своб . - концентрация ПАВ, несвязанного белком.

C БСА , мкМ

Рис. 5. Относительная интенсивность флуоресценции БСА             Рис. 6. Концентрации ЦТАБ, в зависимости от концентрации ЦТАБ при концентрациях        необходимые для достижения данного

БСА С _БСА - 10⁵, М: 0,5(1), 1,0(2), 1,5(3), рН =5,8, Т=293К          значения относительной интенсивности

I/I 0 флуоресценции БСА, в зависимости от концентрации БСА в растворе, для I/I 0 : 0,77(1), 0,60(2), 0,40(3), рН= 5,8, Т=293К

Влияние концентрации БСА на изменение флуоресценции с ростом концентрации ЦТАБ (см. рис. 5) обусловлено равновесным распределением молекул ПАВ между комплексом белок-ПАВ и водной средой, что совпадает с литературными данными [22]. Очевидно следующее соотношение (7):

[ S = [ S своб. + V .[ БСА ].                                   (7)

На рисунке 6 в координатах уравнения (7) представлены зависимости концентрации ЦТАБ от концентрации БСА в смеси при постоянных значениях I/I 0 . Среднее число молекул ПАВ, связанных одной молекулой БСА, рассчитывается по тангенсу угла наклона прямой к оси абсцисс, а концентрация ЦТАБ, несвязанного белком, определяется по точке пересечения прямой с осью ординат. Рассчитанные параметры связывания приведены в таблице 2.

Необходимо подчеркнуть, что образование комплексов белок-ионное ПАВ переменного состава является сложным процессом, сопровождающимся постепенным присоединением молекул ПАВ до насыщения белка и конформационными изменениями макромолекул [5, 10, 20], и вообще говоря, этот процесс не может быть охарактеризован одной константой. Поэтому рассчитанные величины эффективной константы связывания ЦТАБ альбумином (см. табл. 2) позволяют обсуждать лишь оценочные характеристики взаимодействия белка с ПАВ.

Как видно из таблицы 2, константа K b не возрастает с увеличением числа связанных молекул ЦТАБ, что свидетельствует о низкой кооперативности процесса. Этот вывод совпадает с данными таблицы 1, индекс кооперативности для системы ЦТАБ-БСА равен п н =1.57 ± 0.01. Незначительное уменьшение K b при увеличении V может быть обусловлено или конформационными изменениями белка и/или увеличением электростатического отталкивания между заряженными группами ЦТАБ при увеличении числа связанных молекул в условиях низкой кооперативности (при низкой концентрации ПАВ, недостаточной для формирования мицеллоподобных агрегатов на по-липептидной цепи белка).

Таблица 2

Параметры связывания ЦТБА белком при различных значениях относительной интенсивности флуоресценции БСА, рН 5,8, Т=293К

I/I 0	[ S ] своб ⋅ 106, М	ν , моль ЦТАБ/моль БСА	K b ⋅ 10-5, М-1
0,77	12	2,0	1,7 ± 0,7
0,60	39	3,8	1,5 ± 0,5
0,55	38	4,4	1,1 ± 0,6
0,40	135	7,2	0,53 ± 0,04

Выводы

Флуоресценция БСА тушится катионными ПАВ ЦТАБ и ОДМАХ в водном растворе. Константа тушения, представляющая собой константу равновесия связывания молекул ПАВ белком и рассчитанная по уравнению Штерна–Фольмера, равна (4,7 ± 0,2) ⋅ 10³ и (4,3 ± 0,4) ⋅ 10³ М^-1 для ЦТАБ и ОДМАХ соответственно. Тушение происходит преимущественно по статическому механизму [24]. Тушение флуоресценции БСА обусловлено взаимодействием макромолекул белка с молекулами ПАВ, сопровождающимся образованием комплексов БСА – катионное ПАВ. При низких концентрациях ПАВ комплексообразование характеризуется низкой кооперативностью 1 < n н < 2, общее число связанных молекул ПАВ примерно равно числу анионных групп в молекуле БСА. В процессе последовательного увеличения числа молекул ПАВ в комплексе эффективная константа связывания несколько уменьшается. Существенный вклад, наряду с электростатическими взаимодействиями, вносят гидрофобные взаимодействия между молекулами катионного ПАВ и БСА. Длина волны максимума флуоресценции комплекса БСА – катионное ПАВ сдвинута на 4-8 нм в коротковолновую область по сравнению со спектром флуоресценции БСА.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант РФФИ № 10-03-00310-а.