Защита белков и липидов плазмы крови от повреждения, индуцированного этанолом и ацетальдегидом

Обнаружена способность карнозина повышать устойчивость эритроцитов пациентов с алкогольной зависимостью к гемолизирующим факторам [9, 10]. Карнозин взаимодействует со свободными радикалами, активными формами кислорода (АФК), снижая их окислительный потенциал [11], может активировать антиоксидантные ферменты [12, 13]. В то же время исследований возможности защиты карнозином биомолекул плазмы крови человека от окислительной модификации, индуцированной этанолом или ацетальдегидом, ранее не проводилось.

Цель исследования. Оценить защиту карнозином белков и липидов плазмы крови от окислительного повреждения, вызванного этанолом или ацетальдегидом.

Методы исследования . Для оценки динамики окисления белков и липидов плазмы крови под действием Э или АА кровь инкубировали при 37ºС с Э (0,5 %) или АА (0,01 %) соответственно. Из каждой пробы отбирали аликвоты через 0, 1, 2 и 3 часа, которые центрифугировали для получения плазмы крови. В плазме оценивали окислительную модификацию белков по содержанию карбонилов [14] и окислительную модификацию липидов по продуктам, взаимодействующим с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реактивные продукты, ТБК-РП) [15]. Качественную оценку молекулярной массы белков плазмы крови проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) по Леммли [16]. Использовали 4 %-й концентрирующий (рН 6,8) и 10 %-й разделяющий (рН 8,8) гели. Образцы для оценки воздействия Э или АА на белковый спектр плазмы получали после инкубации крови 1 час при 37ºС в присутствии 0,5 % Э или 0,1 % АА. Для оценки эффекта карнозина его добавляли в соответствующие пробы до конечной концентрации 5 мМ перед Э или АА. После ЭФ в ПААГ анализ молекулярной массы полос проводили с помощью специального пакета компьютерных программ Alliance 2.7 Uvitec Cambridge (США): молекулярная масса каждой белковой полосы рассчитывалась автоматически относительно белковых маркеров фирмы Fermentas Scientific (5— 250 кДа). Использовали 96 %-й этиловый спирт из пищевого сырья, ацетальдегид фирмы Sigma (USA), карнозин фирмы «Yonezawa Hamari Chemicals, Ltd» (Япония). В контрольные пробы вместо Э и АА добавляли равное количество физиологического раствора.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета компьютерных программ «Statistica», версия 8.0 для Windows. Данные представляли в виде M±m, где M – среднее значение, m – стандартная ошибка среднего значения. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты и обсуждение. В контрольных пробах (без Э и АА) не обнаружено достоверных изменений между образцами без карнозина и с карнозином в течение 3 часов наблюдения. При этом в образцах без карнозина через 3 часа выявлено достоверное повышение содержания карбонилов белков относительно 0 часов инкубации (р<0,05), что свидетельствует о спонтанном окислении белков (табл. 1).

Таблица 1

Влияние карнозина на содержание карбонилов белков (нмоль/мг белка) в плазме при инкубации крови человека с этанолом и ацетальдегидом (М±m)

Время инкубации	Контроль		Э, 0,5 %		АА, 0,01 %
	Без карнозина (n=20)	Карнозин 5 мМ (n=20)	Без карнозина (n=15)	Карнозин 5 мМ (n=15)	Без карнозина (n=18)	Карнозин 5 мМ (n=18)
0 часов	0,27± 0,01	0,27± 0,01	0,32± 0,02*	0,31± 0,02*	–	–
1	0,28±	0,28±	0,35±	0,29±	3,78±	1,73±
час	0,01	0,01	0,02*	0,02#	0,21*	0,14*#
2	0,29±	0,29±	0,35±	0,28±	3,00±	1,36±
часа	0,01	0,01	0,02*	0,02#	0,17*^	0,12*#^
3	0,31±	0,29±	0,35±	0,28±	2,52±	1,10±
часа	0,01 +	0,01	0,02*	0,02#	0,16*^	0,09*#^

Примечание . * – р<0,01 по сравнению с контрольными значениями; # – р<0,01 между соответствующими значениями в пробах: без карнозина и в присутствии карнозина; + – р<0,05 по сравнению с показаниями в 0 часов инкубации; ^ – р<0,01 по сравнению с показаниями в 1 час инкубации; n – количество доноров

В контрольных пробах с карнозином достоверного повышения карбонилов белков в плазме крови с увеличением времени инкубации относительно нулевой точки не происходило. То есть карнозин тормозит процесс спонтанного окисления белков.

При добавлении 0,5 %-го Э сразу (в 0 часов инкубации) наблюдается достоверный рост кар-бонилированных белков (р<0,01). Через 1 час инкубации уровень карбонилов стабилизируется, оставаясь повышенным относительно контрольных значений (р<0,01). При добавлении 5 мМ карнозина в пробы с Э через 1 час инкубации обнаружено достоверное снижение карбонилов белков относительно значений в пробах с Э без карнозина (р<0,01). Дальнейшая инкубация (2 и 3 часа) крови с Э в присутствии карнозина приводит к снижению уровня карбонилиро-ванных белков до контрольных значений. Эти данные свидетельствуют о том, что карнозин является эффективным протектором белков плазмы крови от окислительного повреждения, вызванного этанолом.

Добавление в кровь АА приводило к существенному (более чем на порядок) увеличению карбонилов белков в плазме крови по сравнению с контролем во всех временных точках (табл. 1). Такое повышение может быть связано не только с образованием карбонилов белков, но и с тем, что при измерении карбонилов белков не весь свободный ацетальдегид отмывал- ся от белков, и его (ацетальдегида) карбонильная группа также вносила свой вклад в определяемые карбонилы. Уровень карбонилов достоверно уменьшался (р<0,01) по мере увеличения времени инкубации. Поскольку карбонильная группа ацетальдегида очень активна, она быстро реагирует с белками с образованием аддуктов ацетальдегида с белком [17, 18] и/или приводит к «сшивке» белковых молекул [19]. То есть снижение карбонилов белков в данном случае может быть обусловлено их «маскировкой» в результате образования белковых агрегатов. Добавление 5 мМ карнозина в пробы с 0,01 %-м АА приводило к существенному снижению карбонилов по сравнению с соответствующими пробами без карнозина, но при этом уровень карбонилов оставался повышенным по сравнению с соответствующими контрольными образцами во всех временных точках (р<0,01). Это свидетельствует о том, что карнозин защищает белки плазмы крови и от окисления, индуцированного АА.

Для проверки предположения об образовании белковых агрегатов в плазме крови были проведены специальные исследования белкового спектра плазмы после инкубации крови с 0,1 %-м АА или с 0,5 %-м Э. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Молекулярная масса белковых полос исследуемых образцов плазмы крови после ЭФ в ПААГ, кДа

А	Б	В	Г	Д
Белковые стандарты (250—5) кда	Контроль	Этанол 0,5 %	Ацетальдегид 0,1 %	Ацетальдегид 0,1 % + Карнозин 5 мМ
п				TZ
л ■	1	1	JL
-	-	-	334		-
250	-	-	-	280
-	-	-	204	-
-	162	179	-	192
150	-	-	-	125
100	100	105	112	-
-	79	82	-	-
70	70	-	-	69
-	59	59	-	-
50	57	-	56	-
-	48	48	46	47
40	42	40	-	-
-	-	37	-	-
30	34	-	32	-
20	24	21	-	28
5	-	-	-	-

При сравнении белковых спектров контрольного образца (столбец Б) и образца плазмы крови после инкубации с 0,5 %-м Э (столбец В) очевидно, что Э никакого влияния на белковый спектр не оказывает.

Этот же вывод следует и из числовых значений молекулярных масс белковых полос анализируемых гелей, представленных ниже в этой таблице.

После инкубации крови с АА (0,1 %) появляется полоса в высокомолекулярной области, соответствующая белку с молекулярной массой 334 кДа (столбец Г), которая отсутствует как в контрольном (Б), так и в образце с этанолом (В). При этом в образце с АА отсутствуют полосы, соответствующие белкам с массой от 60 до 90 кДа. Это говорит об образовании белковых агрегатов. В образце из крови, инкубированной с АА в присутствии 5 мМ карнозина, белковой полосы с молекулярной массой 334 кДа и выше не обнаружено (столбец Д). Данный факт свидетельствует, что карнозин препятствует «сшивке» белков, индуцируемой ацетальдегидом. Представленные данные подтвердили наше предположение о способности карнозина защищать белки плазмы крови как от карбонилирования, так и от образования белковых агрегатов под действием ацетальдегида.

Для оценки защитного действия карнозина от окислительного влияния Э и АА на липиды измеряли ТБК-реактивные продукты в тех же пробах (табл. 3).

Таблица 3

Влияние карнозина на содержание ТБК-реактивных продуктов (нмоль/мл) в плазме при инкубации крови человека с этанолом и ацетальдегидом (М±m)

Время инкубации	Контроль		Э, 0,5 %		АА, 0,01 %
	Без карнозина (n=15)	Карнозин 5 мМ (n=15)	Без карнозина (n=10)	Карнозин 5 мМ (n=10)	Без карнозина (n=12)	Карнозин 5 мМ (n=12)
0	2,50±	2,50±	2,86±	2,70±	4,08±	4,06±
часов	0,10	0,11	0,14*	0,15	0,11**	0,11**
1	2,56±	2,55±	3,31±	2,44±	3,67±	3,93±
час	0,11	0,10	0,06*+	0,11##	0,10**+	0,08 ** #
2	2,65±	2,63±	3,36±	2,32±	не	не
Часа	0,11+	0,10	0,10*+	0,10##	определяли	определяли
3	2,73±	2,69±	3,45±	2,23±	3,62±	3,26±
часа	0,10 +	0,10	0,09*+	0,09 * ##	0,11**+	0,08 ** #+

Примечание . * – р<0,05, ** – р<0,01 по сравнению с контрольными значениями; ^# – р<0,05, ^## – p<0,01 между соответствующими значениями в пробах: без карнозина, в присутствии карнозина; + – р<0,05 по сравнению с показаниями в 0 часов инкубации; n – количество доноров.

Видно, что содержание ТБК-РП в контрольных образцах без карнозина достоверно превышает исходный уровень уже через 2 часа инкубации, через 3 часа происходит их дальнейший рост (р<0,05), что говорит о спонтанном окислении липидов в плазме крови. В контрольных образцах в присутствии карнозина достоверного повышения ТБК-РП в течение всего времени наблюдения не происходило, то есть карнозин тормозит процесс спонтанного окисления липидов.

Таким образом, при 37ºС спонтанному окислению подвергаются как белки, так и липиды плазмы крови. Окисление липидов идёт быстрее, чем окисление белков.

В присутствии 0,5 %-го Э по мере увеличения времени инкубации уровень ТБК-РП в плазме крови достоверно увеличивается и становится выше соответствующих показателей не только контроля (р<0,05), но и показателей в 0 часов инкубации (р<0,05). То есть Э индуцирует окислительную модификацию липидов плазмы крови. Добавление карнозина в пробы с Э приводит к снижению ТБК-РП относительно образцов без карнозина. Содержание ТБК-РП снижается и по мере роста времени инкубации: через 3 часа в пробах с карнозином уровень ТБК-РП становится достоверно ниже контрольных значений (р<0,05).

При добавлении в кровь 0,01 %-го АА содержание ТБК-РП существенно возросло по сравнению с контрольными значениями (р<0,01). Причем в нулевой точке уровень ТБК-РП был максимальным, через час инкубации он достоверно снизился (р<0,05), а в последующие 3 часа инкубации оставался практически на том же уровне, при этом был достоверно выше (р<0,01) соответствующих контрольных значений. Снижение ТБК-РП в этих условиях может быть связано с образованием из них альдегидных гибридных аддуктов, о чем сообщается в литературе [13, 14]. В пробах с АА и карнозином через 1 час инкубации содержание ТБК-РП достоверно превышало их уровень в пробах с АА без карнозина (р<0,05), а через 3 часа произошло достоверное снижение этих продуктов относительно 0 часов инкубации (р<0,05). Вероятно, карнозин препятствовал взаимодействию ТБК-РП с АА, что затрудняло образование гибридных аддуктов и приводило к увеличению ТБК-РП через 1 час инкубации. При более длительном воздействии (3 часа) карнозин, вероятно, успевал прореагировать с ТБК-РП, что и приводило к достоверному снижению их уровня.

Заключение. Результаты исследования показали, что этанол и ацетальдегид in vitro индуцируют окислительную модификацию белков и липидов плазмы крови. Карнозин эффективно защищает и белки, и липиды от окислительного повреждения, вызванного воздействием как этанола, так и ацетальдегида.