Жизнеспособность клеток кератиноцитов линии HaCaT и фибробластов линии 1608hT при воздействии гидролатов растений-эндемиков Республики Бурятия

Растительные сообщества, формирующиеся в изолированных экологических нишах, продуцируют специфический спектр вторичных метаболитов, необходимых для адаптации к локальным условиям среды. Республика Бурятия обладает уникальной флорой, богатой эндемичными видами, которые представляют высокий интерес для биофармацевтики. Особое внимание исследователей привлекают гидролаты (ароматические воды), получаемые методом паровой дистилляции. Несмотря на их широкое использование в косметологии, научные данные о влиянии гидролатов на клеточном уровне остаются фрагментарными [3; 4].

Разработка дерматотропных средств требует понимания механизмов их воздействия на основные клеточные популяции кожи: кератиноциты, формирующие эпидермальный барьер, и фибробласты, отвечающие за синтез матрикса дермы. Эти клетки обладают различными метаболическими потребностями и реактивностью [6; 7], что делает их идеальной моделью для скрининга активности новых препаратов.

Объектом данного исследования стала полынь селитряная Artemisia nitrosa — эндемик, произрастающий в Республике Бурятия, отличающаяся интересным составом биологически активных веществ [5].

Цель работы заключалась в оценке жизнеспособности разных клеточных линий (кератиноциты HaCaT и фибробласты 1608 hT) в условиях in vitro при воздействии гидролата полыни селитряной Artemisia nitrosa .

Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть исследования выполнена в лаборатории регенеративной биомедицины ООО «Малое инновационное предприятие “Байкальский центр биотехнологий”». В работе применялись стандартные протоколы клеточной биологии, регламентирующие условия культивирования, пассажирования и оценки состояния клеточных культур [1].

Объект исследования

Гидролат полыни селитряной Artemisia nitrosa , полученный при паровой ди-стиляции во время изготовления эфирного масла. Образец получен в лаборатории инновационной фармацевтики кафедры фармации Бурятского государственного университета имени Доржи Банзарова и хранился при температуре 4 °C.

Клеточные модели: в работе использованы стандартизированные линии клеток:

• 1)    иммортализованные кератиноциты человека HaCaT (43-й пассаж);

• 2)    дермальные фибробласты человека линии 1608 hT (74-й пассаж).

Культивирование проводили в стерильных условиях (37 °C, 5% CO ₂ , влажная атмосфера) в CO2-инкубаторе Binder C 150 E2 (Германия). Работа с культурами осуществлялась в ламинарном боксе биологической безопасности БМБ-II-«Ламинар-С»-1,5 (Lamsystems, Россия) с использованием центрифуги медицинской СМ-6М (ELMI, Латвия). Использовали питательную среду DMEM (ПанЭко, Россия). Для поддержания роста в среду добавляли 10%-ной фетальной бычьей сыворотки (GloblKang, Китай) и комбинацию антибиотиков пеницил-лин/стрептомицин, гентамицин (ПанЭко, Россия).

Схема эксперимента: рабочие растворы гидролата готовили разведением в полной ростовой среде до концентраций 5, 10, 15 и 20% (по объему). Посев клеток осуществляли в культуральные флаконы площадью 25 см2 с плотностью 1х105 клеток/флакон.

Контрольные группы:

• •    положительный контроль (К+): полная питательная среда DMEM (оптимальные условия);

• •    отрицательный контроль (К-): среда DMEM без фетальной сыворотки.

Время экспозиции составило 7 суток. Ежедневный мониторинг состояния монослоя и фотодокументирование результатов осуществляли с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного цифровой камерой-видеоокуляром ToupCam 5.1 MP (сенсор Aptina MT9P001, разрешение 2592×1944 пикселей, производитель ToupTek Photonics).

Количественный анализ: для объективизации результатов по окончании 7 суток культивирования проводили подсчет клеток в камере Горяева. Каждая точка эксперимента анализировалась в трехкратной повторности.

Результаты и их обсуждение

Применение клеточных технологий in vitro является «золотым стандартом» современной фармакогнозии для первичного скрининга биологической активности и токсичности. Использование монослойных культур позволяет исключить влияние системных факторов организма и оценить прямое действие вещества на клетки-мишени [11]. В данном исследовании мы сравнили реакцию эпителиальных клеток человека на воздействие гидролата полыни селитряной.

Влияние на кератиноциты (HaCaT, пассаж 43).

В контрольной группе (К+) кератиноциты формировали типичный плотный пласт полигональных клеток, свидетельствующий об активном делении. Дефицит сыворотки (К-) ожидаемо снижал плотность культуры. Внесение гидролата Artemisia nitrosa в концентрациях от 5 до 15% не вызывало видимых изменений морфологии или плотности монослоя по сравнению с отрицательным контролем. При концентрации гидролата полыни 20%-ной количество клеток сократилось, но признаки цитопатического действия (вакуолизация, округление, открепление от субстрата) отсутствовали. Это позволяет сделать вывод об отсутствии цитотоксичности гидролата для клеток эпидермиса в изученном диапазоне.

Влияние на фибробласты (1608 hT, пассаж 74).

В оптимальных условиях (К+) фибробласты образовывали конфлюэнтный монослой веретеновидных клеток. Низкие дозы гидролата (5, 10%) не влияли на состояние культуры. Однако при повышении концентрации до 15% наблюдалась специфическая реакция: плотность клеточного пласта снижалась по сравнению с контролем. Клетки не сохраняли типичную структуру, многие были не адгезивны. Такая картина характерна для цитостатического эффекта — торможения клеточного цикла.

При подсчете клеток экспериментальных и контрольных групп получили следующие данные жизнеспособности.

Рис. 1. Влияние гидролата полыни на жизнеспособность клеток кожи человека

Полученные данные свидетельствовали об избирательной чувствительности клеток кожи к компонентам гидролата полыни селитряной Artemisia nitrosa . Из представленных данных видно (рис. 1), что концентрации гидролата полыни 5, 10 и 15% вызывали активную пролиферацию кератиноцитов линии НаСаТ на 16 и 3% соответственно, в сравнении с данными контрольной позитивной группы. При добавлении в среду к кератиноцитам 20%-ного гидролата полыни отметили снижение количества клеток на 12%, эти данные говорят об отсутствии цитотоксичности указанных доз на клеточные линии НаСаТ. При внесении 5% и 10% гидролата полыни в среду для культивирования фибробластов линии 1608 hT наблюдали рост клеток до значений контрольной группы, но при повышении концентрации гидролата до 15, 20% количество клеток понизилось на 38% и 60% соответственно от данных контрольной группы. Таким образом, две последние концентрации оказали цитотоксический эффект на клетки фибробласты. Морфологические различия клеток в экспериментальных группах представлены на рисунках 2 и 3.

Выявленная избирательность воздействия гидролата может объясняться следующими факторами:

• 1.    Метаболические различия. Фибробласты в культуре более зависимы от внешних факторов роста, тогда как иммортализованные линии (HaCaT) обладают высокой автономностью деления [8; 9]. Возможно, компоненты гидролата блокируют специфические сигнальные пути, важные именно для фибробластов.

• 2.    Фитохимическая специфичность. Эндемик может синтезировать уникальные молекулы, таргетно воздействующие на рецепторы фибробластов.

Обнаруженный эффект «мягкого» торможения фибробластов при сохранении жизнеспособности кератиноцитов представляет интерес для дерматологии. Такой профиль активности востребован при создании средств для коррекции гипертрофических рубцов и келоидов, где необходимо сдерживать избыточный рост соединительной ткани, не повреждая эпидермис [11; 12].

а) морфология кератиноцитов линии HaCaT (пассаж 43) в контрольной группе (К+)

b) морфология кератиноцитов линии HaCaT (пассаж 43), с добавлением 20%-ного гидролата полыни

Рис. 2. Морфология кератиноцитов линии HaCaT (пассаж 43) через 7 суток культивирования. В сравнение: положительный контроль и максимальная экспериментальная концентрация гидролата полыни селитряной 20%-ной

а) морфология фибробластов линии 1608 hT (пассаж 74) в контрольной группе (К+)

b) влияние гидролата Artemisia nitrosa 5% на фибробласты линии 1608 hT (пассаж 74)

с) влияние гидролата Artemisia nitrosa 10% на фибробласты линии 1608 hT (пассаж 74)

d) влияние гидролата Artemisia 15% на фибробласты линии 1608 hT

(пассаж 74)

Рис. 3. Влияние гидролата полыни Artemisia nitrosa на фибробласты линии 1608 hT (пассаж 74)

Выводы

В результате исследования установлено, что гидролат эндемика Artemisia nitrosa обладает избирательной биологической активностью in vitro : в концентрациях гидролата полыни 5–10% наблюдается положительное влияние на пролиферацию всех изучаемых клеток, дальнейшее повышение концентрации гидролатов в културальной среде оказало дозозависимый цитостатический эффект на дермальные фибробласты (15–20%), не влияя пагубно на жизнеспособность ке-ратиноцитов. Выявленная активность делает гидролат полыни селитряной перспективным средством для разработки средств, модулирующих процессы рубцевания и ремоделирования дермы. Полученные данные служат основанием для проведения более глубоких исследований, включая изучение молекулярных мишеней для действия гидролата.