Значение протеомного состава мочи при заболеваниях мочевыводящих путей (обзор литературы)

экспериментальная и клиническая урология № 1 2 0 17

Высокочувствительные масс-спектрометрические методы способствовали получению новых данных о белковом составе жидкостей тела человека как в норме, так и при патологии. Считается, что наиболее значимые успехи в плане практического применения масс-спектрометры имеют в области исследований протеома мочи [34]. Современные методы разделения белковых смесей и определения отдельных компонентов этих смесей с применением масс-спектрометрии позволили определить в образцах мочи человека до 3500 различных белков [35]. Современная диагностика изменений белкового состава мочи с помощью MALDI–TOF масс-спектрометрии в течение ряда лет успешно применяется сотрудниками лаборатории «Протеомики» Института медико-биологических проблем в исследованиях протеом-ного состава мочи при действии реальных и моделируемых факторов космического полета. Успешно решен ряд сложных проблем, сдерживающих продвижение исследований в физиологии и клинике. Отработана система пробоподготовки, стандартизирован ее преаналитиче-ский этап применительно к такому клиническому биоматериалу, как моча.

Нивелирован целый ряд недостатков программного обеспечения, затрудняющих достоверную интерпретацию результатов. Тщательно разработан весь процесс, требуемый для исследования протеомного состава мочи, включающий:

– Преаналитический этап – сбор мочи, методы проведения про-боподготовки. Установлено, что аналитическая воспроизводимость исследования белкового состава мочи масс-спектрометрическими методами не зависит от продолжительности замораживания, образец остается стабильным в течение нескольких лет, даже при хранении при -20 °C. Воспроизводимость поддерживается и в образцах, сохраняемых до 5-6 часов при комнатной темпера- туре, или до трех дней при 400С, за счет небольшого количества протеаз в данном биологическом материале. Пробоподготовку для дальнейшего анализа протеомного состава мочи осуществляют согласно стандартному протоколу (протокол обработки мочи для скрининга, HUPO-2007, Сеул, Корея) [36].

– Аналитический этап – при получении масс-спектров применяют различные хромато-масс-спектрометрические системы. Например, система может состоять из хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., США) и гибридного масс-спектрометра LTQ-FT Ultra (Thermo, Германия). В этом случае хроматографическое разделение смеси белков после трипсинолиза проводят на базе нанопоточ-ного высокоэффективного жидкостного хроматографа (нано-ВЭЖХ) Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, США). Для градиентной хроматографии применяют home-made колонку с использованием капилляра-эммитера (Pico-tip, New Objective Inc., США), описанную Y. Ishihama и др. [37].

Как правило, из каждого образца мочи получают два образца триптической смеси, которую анализируют трижды на масс-спектрометре. Для последующего анализа отбираются лишь те белки, которые были обнаружены в двух или трех повторах. Целесообразность такой «строгости» оспаривается рядом специалистов, работающих с образцами мочи (частные дискуссии). Их аргументация сводится к доводу, что если в образце однажды (в одном из прогонов) был достоверно идентифицирован тот или иной белок, то это свидетельствует о том, что он есть в образце, и скорее надо критиковать те масс-спектрометрические прогоны, в которых он не выявлялся. В качественной протеомике мочи о динамике изменения протеома судят по частоте встречаемости белков в образцах, считая, что факт обнаружения белка в образце, при сохранении чувствитель- ности LC/MS метода, связан с его концентрацией.

• - Постаналитический этап – применение комплекса современных биоинформационных технологий, включающих в себя: 1. Поиск и идентификация белков по базе данных IPI-human при помощи программы Mascot; 2. Обработка с помощью уникальной программы, разработанной в лаборатории профессора Е.Н. Николаева [38], результатов Mascot-поиска; 3. Применение комплекса биоинформационных ресурсов для определения места образования, функции выявленных в моче белков, а также для анализа биологических процессов, в которых они участвуют; 4. Анализ ткане-специфичности экспрессии и тканевой локализации белков; определение молекулярных функций, биологических процессов и клеточной локализации; сверхпредставленности биологических процессов, молекулярных функций, связанных с выявленными белками; построение ассоциативных генных сетей между белками.

Для определения места образования в организме и биологической функции выявленных белков, а также для анализа биологических процессов, в которых они участвуют, применяют следующие био-информационные ресурсы: UniPro-tKB [], TiGER [], Gene Ontology [http://geneontology. org/]. Для определения сверхпред-ставленных биологических процессов используют программу BiNGO со следующими параметрами: статистический критерий — гипергеометрический критерий; поправка на множественное сравнение Бен-жамина Хохберга; уровень значимости: 0,05; референсная выборка – полная аннотация, как референсная выборка; файл онтологии — Custom, Gene Ontology (format-version:1.2 data-version: 2013– 08–21); организм/аннотация: GO Annotation_Human (Submission Date: 8/5/2013).

ТРУДНОСТИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО СОСТАВА МОЧИ ЧЕЛОВЕКА

ПРОТЕОМНЫМИ МЕТОДАМИ

Существуют объективные и до сих пор не преодоленные трудности в интерпретации результатов исследования протеома мочи, в определенной степени сдерживающие широкое использование технологий протеомики в клинической области. Их можно условно разделить на следующие категории.

• 1.    Высокая индивидуальная («продольная») вариабельность про-теома мочи. При сопоставлении белкового состава образцов мочи одного и того же человека (здорового или пациента в процессе диагностики, или мониторинга терапии) необходимо увидеть значимые изменения в составе и по ним сделать заключение того или иного характера. При этом нельзя не принимать во внимание, что белковый состав мочи, главным образом, зависит от:

• -    белкового состава крови (вариабельность которого, при изучении методами протеомики на основе масс-спектрометрии, составляет около 25% [38]. По данным О.М. Трифоновой индивидуальная вариабельность белкового состава крови здоровых добровольцев в контролируемых условиях, исследованная на протяжении 3 недель, составила 22±13% [39].

• -    вариабельность белкового состава мочи зависит также от актуальной функции почки, как эффекторного органа поддержания водноэлектролитного гомеостаза внутренней среды организма. Этот аспект практически не исследован, за исключением небольшого числа работ, выполненных с участием здоровых добровольцев или пациентов разных нозологических групп.

Сообщается, что «продольная» вариабельность белкового состава мочи при маcс-спектрометрическом исследовании составляет 45%, или достигает 58% [40, 41]. По нашим данным, полученным при исследовании здоровых добровольцев в контролируемых условиях потребления основных нутриентов, жидкости, двигательной активности, состава атмосферы в замкнутом объекте – даже численный состав белков в моче может сильно варьировать при сравнении двух последовательных недель наблюдения (рис. 1) [42]. При исследовании проб мочи 30,7% из числа выявляемых прямым профилированием пиков у здорового человека имеют «продольную» вариабельность, вдвое превышающую аналитическую на протяжении времени обследования в 3 месяца [43].

1-2 2-3 3-4 4-5   5-6 6-7 7-8 8-10 10-11 11-12 12-13 13-14

Сравниваемые недели

■ только 1-ая неделя ■ пересечение “ только 2-ая неделя

Рис. 1. Изменения белкового состава мочи, собранной еженедельно (при сравнении двух последовательных недель)

ТРУДНОСТИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПРОТЕОМИКИ МОЧИ

Получение количественных данных об экскреции различных белков почкой методами протеомики на основе масс-спектрометрии сейчас абсолютно реально. Разработано множество методических подходов, дающих воспроизводимые и точные, в том числе количественные, данные по протеому мочи человека [44,45,46]. Тем не менее, эти прорывы в приборостроении, разработке различных методов намного опередили возможности использования их результатов медиками в диагностических и других целях.

Еще два десятилетия назад были получены результаты исследований, которые говорили о возможности увеличения экскреции белка, зависящей от некоторых непатологических факторов, таких как интенсивная физическая нагрузка, ортостаз, лихорадка, эмоциональный стресс. Увеличение экскреции некоторых белков почкой может наступать и при изменении скорости мочеотделения. Тем не менее, факторы регуляции уровня экскреции белка почкой не описаны. Остаются открытыми вопросы о пределах вариабельности и механизмах влияния процессов, лежащих в основе мочеобразования, на уровень экскреции белка в норме. Это обстоятельство не дает возможности установить референсные интервалы для экскреции различных белков с мочой. Выяснение условий развития физиологической протеинурии представляет безусловный интерес, как для нормальной физиологии, так и для практической медицины.

экспериментальная и клиническая урология № 1 2 0 17

Резюме:

Одним из направлений совершенствования методов персонализированной медицины является клиническая протеомика, участвующая в работе по открытию биомаркеров различных заболеваний. Внедрение в клиническую практику методов иммуноферментного анализа показало, что целый ряд мочевых белков может быть использован для оценки состояния почечной паренхимы, мочевыводящих путей, заболеваний сердечно-сосудистой системы и др. Новой и одной из самых мощных и широко применяемых в целях поиска биомаркеров технологий является масс-спектрометрия, позволяющая получать информацию сразу о сотнях белков. Современная диагностика изменений белкового состава мочи с помощью MALDI–TOF масс-спектрометрии в течение ряда лет успешно применяется в исследованиях протеомного состава мочи при действии реальных и моделируемых факторов космического полета. Успешно решен ряд сложных проблем,