Анализ антибиотикорезистентности бактерий кишечной микрофлоры

Болезнетворные микроорганизмы и остатки антибиотиков являются основными вредными композициями в навозе (фекалиях, накопленных в естественных условиях) [6]. Согласно статистике ВОЗ, ежегодно в мире насчитывается около 1,5 миллиарда пациентов с диареей, и 70% этих случаев были вызваны пищей, зараженной микроорганизмами [7, 8]. Патогенные микроорганизмы могут выживать в воде, почве и других областях окружающей среды в течение длительного времени, а затем влиять на здоровье человека через сельскохозяйственные культуры или продукты животного происхождения [4, 9]. В настоящее время в фекалиях идентифицировано более 150 патогенов.

Опасности накопленного коровьего навоза уделяется меньше внимания, при этом он широко используется для выращивания сельскохозяйственных культур или овощей [10, 11]. На сегодняшний момент имеется мало информации об уровнях и изменениях патогенных бактерий, входящих в состав фекалий крупного рогатого скота и их антибиотикорезистент-ности, на молочных фермах [5, 7]. Таким образом, необходим мониторинг антибиотико-резистентности бактерий, выделяемых из отходов животноводческих ферм.

Цель работы - изучение состава фекальной микрофлоры и анализ ее антибиотикорезистентности.

Результаты и обсуждение. Для бактериологического исследования отбирали пробы свежих фекалий крупного рогатого скота (КРС) животноводческой фермы ООО ОПХ «Солянское», Рыбинского района Красноярского края, в 7 точках: дойная база, септик-1, база КРС, септик-2, база КРС, септик-3, база №17, база №15, д. Рябинки база «решетка» и база 9. Отбирали 1,0 г навоза в трёх повторностях и далее делали смешанную пробу.

Для подсчета количества колоний и выделения чистой культуры предварительно разводили образцы в стерильно физиологическом растворе 0,8% в пробирках до 10-кратного и полученные последовательные 10-кратные разведения засевали на чашки Петри с различными селективными, обогащенными и дифференциально-диагностическими средами (агар Сабуро – для выявления грибов, среда обогащения магниевая, агар Плоскирева, агар Левина, желточносолевой агар, агар Эндо, кровяной агар, агар для лактобактерий, агар для бифидобактерий, среда Вильсон-Блер - для обнаружения клостридий, лактозный ТТХ агар с тергитолом 7 – для выделения энтерококков). Питательные среды подбирали для выделения кишечной микрофлоры, подбор питательных сред проводился для выделения аэробных и анаэробных микроорганизмов (более 20 видов патогенной, условно-патогенной и сапрофитной микрофлоры). Количественное содержание микроорганизмов в 1,0 г биоматериала определяли путем подсчета выросших на чашках Петри колоний (для каждого разведения отдельно). Далее все серийные разведения помещали в термостат при температуре 37ºС на 18–24 часов. Далее оценено наличие и осуществлен подсчет микроорганизмов и высев колоний на среду Олькеницкого, магниевую среду, висмут-сульфидный агар и агар Левина, посевы инкубировали при 37ºС в течении 18–24 часов. Далее оценивали рост на дифференциальнодиагностических средах и проводили окраску по Граму и микроскопирование для выделения чистой и изолированной культуры, с последующей идентификацией до вида. Для видовой идентификации бактерий и грибов в навозе был применен метод масс-спектрометрии.

Далее определяли антибиотикорезистент-ность микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом. Антибактериальные препараты наносились диспенсером на чашки Петри с Мюллер-Хинтон агаром. Агар предварительно подсушили при комнатной температуре с нанесенным на него инокулюмом исследуемой культуры 0,5 по стандарту МакФарланда. Далее инкубировали при 37°С в течении 18-24 часов, по истечении времени оценивали зону задержки роста антибактериального препарата и исследуемого микроорганизма на аппарате ADAGIO, который автоматически считывает зоны задержки роста. Для определения анти-биотикорезистентности микроорганизмов, выделенных из отходов молочной фермы, были использованы диски с такими антимикробными препаратами, как ампициллин в двух дозировках (2 мкг и 10 мкг), амоксициллин + клавулановая кислота 20\10 мкг, бензилпенициллин 1 МЕ, тетрациклин 30 мкг, эритромицин 15 мкг.

Результаты и обсуждение. В результате микробиологического анализа смешанных частей свежих фекалий, полученных с разных септиков, было установлено, что наибольшее количество представителей кишечной микрофлоры относятся к сапрофитным бактериям, бифидобактерии и лактобактерии, количество которых превышало 108 – 1010 на 1 мл образца (табл. 1 и 2).

Таблица 1 – Количественный и качественный состав кишечной микрофлоры крупного рогатого скота, уровень антибиотикорезистентности к полусинтетическим пенициллинам

Таблица 2 – Количественный и качественный состав кишечной микрофлоры крупного рогатого скота, уровень антибиотикорезистентности к макролидам и тетрациклинам

Также было выявлено высокое значение а-гемолитических (зеленящих) стрептококков, из которых чаще всего выявлялись S. dysgalactiae и S. equi, которые являются зоонозами и вызывают инфекционные заболевания у коров. Такие микроорганизмы, как гемолитические E. coli, P. aeruginosa и B. subtilis выявлялись в концентрации 10⁶ KOE/мл, немногим меньше, в количестве 10⁵ KOE/мл представлены бактерии E. faecalis, A. calcoaceticus и А. Iwoffii , а также клостридии и сарцины.

Данные бактерии относятся к условно -патогенным и способны при попадании в молочную продукцию вызывать различного рода инфекционные заболевания у человека. Исследование кишечной микрофлоры показало низкое количество, в диапазоне 10²–10³ KOE/мл, таких микроорганизмов как P. mirabillis, K. pneumoniae, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. aureus, а также грибов родов Candida и Penicillum.

Несмотря на то, что молочные коровы используют антибиотики реже, чем другие мясные животные, в коровьем навозе также обнаруживаются лекарственные препараты и бактерии, резистентные к широкому спектру антибиотиков. Распространение таких бактерий может ограничивать терапевтический потенциал антибиотиков, тем самым создавая потенциальную угрозу для здоровья людей и скота [7]. Таким образом особый интерес представляет изучение антибиотикорезистент-ности бактерий, выделенных из кишечной микрофлоры КРС. Противомикробные препараты уже несколько десятилетий широко используются в традиционном животноводстве. Показано, что беспорядочное применение антибиотиков в животноводстве создаёт благоприятные условия для быстрой эволюции патогенности и вирулентности микроорганизмов и формирования у них антибиотикорезистент-ности. Наличие в комбикормах даже остаточных количеств антибиотиков может вызвать различные нарушения здоровья людей [3, 9]. Анализ антибиотикорезистентно-сти бактерий кишечной микрофлоры показал, что штаммы P. mirabillis и P. aeruginosa были резистентны ко всем исследуемым классам антибиотиков (макролиды, пенициллины, в том числе и комбинированного состава (амоксициллин + клавулановая кислота) и тетрациклины). Штаммы бактерии S. saprophyticus были чувствительны только к комбинированному антибактериальному препарату – амоксициллин + клавулановая кислота 20\10 мкг. Это комбинированное антибактериальное средство, сочетание бактерицидного антибиотика широкого спектра действия из группы полусинтетических пенициллинов — амоксициллина и ингибитора бета-лактамаз — клавулановой кислоты. E. coli и B. subtilis чувствительны к таким препаратам как амоксициллин + клавулановая кислота и ампициллин в дозировке 10 мкг (относящийся к группе полусинтетических пенициллинов), но проявляли устойчивость к таким антибиотикам, как эритромицин (группа макролидов) и тетрациклин (группа тетрациклинов), а также к некоторым препаратам, относящимся к по-лусинтетическим пенициллинам. Штаммы бактерий вида A. lwoffii проявляли устойчивость в отношении эритромицина, бензилпенициллина и ампициллина в дозировке 2 мкг, но были чувствительны к ампициллину в дозировке 10 мкг, комбинированному препарату и тетрациклину. Наибольшую чувствительность проявляли штаммы бактерии E. faecalis, которые были резистентны только к эритромицину и чувствительны к антибиотикам группы полусинтетических пенициллинов и тетрациклинов, несмотря на то что одной из отличительных особенностей этого класса бактерий является изначальная природная устойчивость к целому ряду антибактериальных препаратов.

В результате анализа антибиотикорези-стентности фекальной микрофлоры показано, что к эритромицину были устойчивы все выделенные штаммы, относящиеся к условно -патогенным бактериям. При этом к данному препарату природную устойчивость проявляют только грамотрицательные палочки: Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa. К бензилпенициллину, ампициллину в дозировке 2 мкг и тетрациклину были устойчивы большинство выделенных штаммов бактерий. Наибольшее количество изученных микроорганизмов были чувствительны к ампициллину в дозировке 10 мкг и комбинированному препарату амоксициллин + клавулановая кислота.

Выводы. Таким образом, выявлена высокая резистентность бактерий кишечной микрофлоры к наиболее популярным препаратам, которые используются в животноводстве, в частности на молочных фермах для лечения КРС. Изученные микроорганизмы вырабатывают устойчивость к препаратам в связи с нерациональным использованием антибиотиков. Антимикробные препараты - это инструмент, используемый на животноводческих фермах для обеспечения здоровья животных, и этот инструмент должен использоваться рационально.