Антимикробная активность экспериментальных образцов средства для сухих ножных ванн

Заболевания копытец, наряду с маститами и патологиями органов воспроизводства, являются одной из самых распространенных и трудно решаемых проблем молочного скотоводства [2, 5]. Первые клинические признаки болезней в виде хромоты «опирающейся конечности» могут появляться лишь на 7-30 сутки. В это время из-за развивающегося патологического процесса, животные испытывают дискомфорт, плохо поедают корма, снижаются приросты, молочная продуктивность, увеличивается сервис-период, кратность осеменения, отход телят, развивается бесплодие [6]. Несвоевременная диагностика приводит к накоплению большого количества больных животных, а их запоздалое индивидуальное лечение с «жесткой» фиксацией и применением дорогостоящих антимикробных и противовоспалительных препаратов, из-за которых бракуется молоко, требует больших материальных и временных затрат. В большинстве случаев прогноз лечения неблагоприятный, поэтому высокопродуктивных животных приходится преждевременно выбраковывать, что напрямую влияет на генофонд и доходность отрасли [9].

В неблагополучных сельхозпредприятиях широкое распространение получают различные ассоциации условно-патогенных микроорганизмов (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Fusobacterium necrophorum и др.), значительно повышающих патогенность при пассажах через организм животных, имеющих низкий уровень местной и общей резистености [8].

В настоящее время для групповой профилактики болезней пальцев и копытец широко применяют ножные ванны с различными дезинфицирующими растворами [1, 3, 7]. Однако при низких температурах дезинфицирующие растворы теряют активность, а в типовых коровниках трудно найти места для установки ножных ванн, требующих дополнительного ограждения. Животные обычно боятся влажных ванн, перепрыгивают через них и могут травмироваться. Кроме того, из-за загрязнения мочой и фекалиями, растворы для ванн приходится часто менять, что приводит к повышению трудозатрат и удорожанию их применения.

Сухие ножные ванны имеют ряд преимуществ перед влажными ваннами, такие как: широкий температурный диапазон использования, легкость дозирования (добавление средства по мере его расхода), экономичный расход порошка, отсутствие скольжения, возможность использования даже без установки специальных ванн и с помощью распылительных устройств, а также вместе с подстилочным материалом. Кроме того, сухие ножные ванны будут способствовать снижению влажности напольных покрытий и улучшению микроклимата помещений, что окажет неблагоприятное влияние на развитие условно-патогенной и патогенной микрофлоры.

В связи с этим, разработка средств для сухих ножных ванн, обладающих выраженными антимикробными свойствами и схемы их применения на ранних стадиях развития инфекционного процесса, является весьма актуальной задачей, позволяющей снизить трудозатраты и повысить рентабельность молочного скотоводства.

Цель исследования заключалась в определении антимикробной активности экспериментальных образцов средства для групповой профилактики и лечения инфекционных болезней дистального отдела конечностей крупного рогатого скота в отношении тест-микроорганизмов.

Материал и методы исследований. Исследования проведены в лаборатории ветеринарной санитарии отделения биотехнологии ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Объектами исследования являлись разработанные экспериментальные образцы средства для сухих ножных ванн, тест-микроорганизмы ( E. coli М-17, S. aureus 209 Р, S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis ВОЗ, Cl. perfringens АТСС 13124, F. necrophorum 8TS630501).

Изучение антимикробной активности экспериментальных образцов проводили суспензионным методом согласно Руководству Р 4.2.3676-20 [4].

При подборе компонентов для создания экспериментальных образцов средства в форме порошка для групповой профилактики и лечения инфекционных болезней дистального отдела конечностей крупного рогатого скота методом сухих ножных ванн учитывали необходимость соответствия следующим требованиям: наличие адсорбционных, бактерицидных, фунгицидных и противовоспалительных свойств; по степени воздействия на организм относиться к умеренно опасным веществам; укрепление копытцевого рога; сохранение сыпучести; слабокислый или кислый рН; отсутствие коррозионного действия на стойловое оборудование; не требовать для своего применения соблюдения температурного режима; успешно применяться в животноводческих помещениях с повышенной влажностью, не требовать точной дозировки; не создавать опасность скольжения при проходе животных через ванну; не требовать специальной процедуры утилизации; применение должно быть экономически выгодным; обладать возможностью применения даже без использования специальных ванн для обработки копытец, а также в смеси с различными подстилочными материалами, используемыми в животноводческих хозяйствах; обладать возможностью добавления в ванну свежего порошка по мере расхода и использования с помощью распылительных устройств; иметь расход порошка в среднем 120-160 г на корову, чтобы 40-50 кг было достаточно для прохождения 300 животных.

Таким образом, при разработке экспериментальных образцов, в качестве компонентов рассматривали: адсорбенты (бентонит, цеолит, кизельгур, перлит), бензолсульфохлорамид натрия, гидроксид натрия, гипохлорит кальция, оксид и сульфат цинка, медный купорос и дополнительные компоненты, взятые в различных соотношениях.

Все смешиваемые сухие вещества предварительно измельчали до одинаковой степени мелкости с помощью лабораторной зерновой мельницы типа СИ ЛЗМ-1, затем объединяли и механически перемешивали.

Рабочую суспензию микроорганизмов готовили из тест-микроорганизмов, выращенных на плотных питательных средах (МПА (E. сoli, S. aureus, S. enterica), ГКА (Cl. perfringens, F. necrophorum)) при температуре от 37 °C до 38 °C в течение от 18 до 24 ч. Для приготовления бактериальной взвеси каждую культуру смывали с агара стерильной питьевой водой. Полученную взвесь микроорганизмов фильтровали через ватно-марлевый фильтр и разводили стерильной питьевой водой до концентрации 2×109 клеток в 1 см3.

Перед постановкой эксперимента готовили растворы экспериментальных образцов в различных концентрациях (от 0,125 % до 4,0 %) на стерильной водопроводной воде. Далее эти растворы по

4,5 см3 разливали в стерильные пробирки, в которые затем добавляли 0,5 см3 взвеси тест-микроорганизма    и    тщательно перемешивали. Через определенные интервалы времени по 0,5 см3 взвеси «тест-микроорганизм+экспериментальный образец» добавляли к       4,5  см3

нейтрализатора (стерильной воды), снова тщательно перемешивали и оставляли на 5 мин. Затем по 0,5 см3 вносили в пробирку с 4,5 см3 стерильной питьевой воды, после чего из этой пробы по 0,1 см3 вносили в пробирку с 5 см3 жидкой питательной среды (МПБ, Китта-Тароцци) и на поверхность плотной питательной среды. В контрольных опытах вместо растворов испытываемых      экспериментальных образцов использовали стерильную водопроводную воду. Экспозиция была выбрана в связи с критериями активности, указанными в Р 4.2.3676-20.

Температура       инкубирования посевов в термостате и сроки учета результатов опыта зависели от вида микроорганизма.    Посевы бактерий термостатировали при температуре (37±1) °C. Учет результатов проводили через 2448 ч. Для подтверждения биоцидного действия экспериментальных образцов из пробирок, в которых отсутствовал рост тест-культуры, ежедневно делали пересев по 0,5 см3 в 4,5 см3 новой порции питательной среды. Результаты опыта оценивали по наличию или отсутствию роста микроорганизмов в жидкой и на плотной питательных средах [4]. Сравнение проводили с контролем, которым    являлся    посев    тест- микроорганизмов в питательную среду без добавления экспериментальных образцов.

При наличии роста на МПБ делали подтверждающий посев на плотную среду МПА. При наличии роста на среде Китта-Тароцци делали подтверждающий посев на ГКА (выращивали в вакууме при остаточном давлении от 5 до 6 мм рт. ст.).

Эффективной            считали концентрацию       экспериментального образца, при которой трижды повторенный опыт при определенном времени воздействия    давал    отрицательный результат       (отсутствие       роста микроорганизмов) при наличии типичного роста тест-культуры в контроле.

За минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) разработанного экспериментального образца принимали концентрацию полностью предотвращающую формирование колоний. Наименьшая концентрация препарата, подавляющая рост тест-культур, служила для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК).

Проведено изучение антимикробной активности трех экспериментальных образцов под шифрами «СВ», «СВ1» и «СВ2». В качестве препарата сравнения использовали коммерческий препарат «Любисан Эко».

Результат исследований.

Результаты определения антимикробной активности в отношении тест-микроорганизмов представлены в таблице 2.

Параллельно ставились контроли стерильности питательной среды и экспериментальных образцов, которые были отрицательными, контроль роста микроорганизмов – положительным.

Значения МИК и МБК представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что показатели активности коммерческого препарата сравнения («Любисан ЭКО») уступали образцам «СВ» и «СВ1», в составе которых максимальную долю занимает бентонит и цеолит соответственно, и находились на одном уровне с образцом «СВ2», где в качестве наполнителя использовался диатомит.

Наиболее выраженной антимикробной активностью в отношении используемых тест-микроорганизмов обладал образец под шифром «СВ», имеющий в своем составе в качестве одного из активнодействующих веществ большее количество бензолсульфохлорамида натрия по сравнению с «Любисан Эко». Бензолсульфохлорамид натрия относится к группе монохлорзамещенных амидов сульфокислот и обладает способностью легко отщеплять атомы «активного хлора», который проявляет окислительные свойства. Молекула бензолсульфохлорамида натрия является низкомолекулярным органическим соединением и легко проникает через мембрану микроорганизмов за счет использования дефектов жидкокристаллической решетки липидного бислоя. Наличие иона натрия, возможно, также облегчает взаимодействие препарата с клеточной мембраной бактерий за счет образования им ион-проводящих агрегатов, увеличивающих анионную проводимость.

Таблица 1 - Антимикробная активность разработанных экспериментальных образцов (n=3)

Микроорганизм / экспозиция с экспериментальным образцом	Наименование образца	Рост на питательной среде	Концентрация раствора экспериментального образца, %
			4,0	2,0	1,0	0,5	0,25	0,125
S. aureus / 30 мин	«СВ»	МПБ	—	—	—	+	+	+
		МПА	—	—	—	+	+	+
	«СВ1»	МПБ	—	—	—	+	+	+
		МПА	—	—	+	+	+	+
	«СВ2»	МПБ	—	—	+	+	+	+
		МПА	—	+	+	+	+	+
	Любисан Эко	МПБ	—	—	+	+	+	+
		МПА	—	+	+	+	+	+
E. coli / 30 мин	«СВ»	МПБ	—	—	—	—	+	+
		МПА	—	—	—	+	+	+
	«СВ1»	МПБ	—	—	+	+	+	+
		МПА	—	—	+	+	+	+
	«СВ2»	МПБ	—	—	+	+	+	+
		МПА	—	+	+	+	+	+
	Любисан Эко	МПБ	—	—	+	+	+	+
		МПА	—	+	+	+	+	+
S. enterica / 30 мин	«СВ»	МПБ	—	—	—	—	—	+
		МПА	—	—	—	—	+	+
	«СВ1»	МПБ	—	—	—	+	+	+
		МПА	—	—	—	+	+	+
	«СВ2»	МПБ	—	—	—	+	+	+
		МПА	—	—	+	+	+	+
	Любисан Эко	МПБ	—	—	—	+	+	+
		МПА	—	—	+	+	+	+
Cl. perfringens / 240 мин	«СВ»	Китта-Т ароцци	—	+	+	+	+	+
		ГКА	—	+	+	+	+	+
	«СВ1»	Китта-Т ароцци	+	+	+	+	+	+
		ГКА	+	+	+	+	+	+
	«СВ2»	Китта-Т ароцци	+	+	+	+	+	+
		ГКА	+	+	+	+	+	+
	Любисан Эко	Китта-Т ароцци	+	+	+	+	+	+
		ГКА	+	+	+	+	+	+
F. necrophorum / 30 мин	«СВ»	Китта-Т ароцци	—	—	—	—	—	—
		ГКА	—	—	—	—	—	+
	«СВ1»	Китта-Т ароцци	—	—	—	—	+	+
		ГКА	—	—	—	+	+	+
	«СВ2»	Китта-Т ароцци	—	—	—	—	+	+
		ГКА	—	—	—	+	+	+
	Любисан Эко	Китта-Т ароцци	—	—	—	—	+	+
		ГКА	—	—	—	+	+	+
Примечания: 1 «+» - наличие роста; 2 «-» - отсутствие роста.

Таблица 2 – Бактериостатическая и бактерицидная активности изучаемых образцов (n=3)

Наименование образца	S. aureus		E. coli		S. enterica		Cl. perfringens		F. necrophorum
	МИК	МБК	МИК	МБК	МИК	МБК	МИК	МБК	МИК	МБК
«СВ»	10,0	10,0	5,0	10,0	2,5	5,0	40,0	40,0	<1,25	2,5
«СВ1»	10,0	20,0	20,0	20,0	10,0	10,0	80,0	80,0	5,0	10,0
«СВ2»	20,0	40,0	20,0	40,0	10,0	20,0	80,0	80,0	5,0	10,0
Любисан Эко	20,0	40,0	20,0	40,0	10,0	20,0	80,0	80,0	5,0	10,0

Примечание: МИК и МБК выражены в мкг/мл.

Заключение. Таким образом, на основе скрининга in vitro для дальнейшего изучения отобран образец под шифром «СВ», показавший максимальную антимикробную активность. Перспективность комбинации, входящих в его состав компонентов, обусловлена не только синергизмом их механизмов действия (повышающих антимикробную, фунгицидную, противовоспалительную активности), но и наличием у средства сорбционных свойств.

Данные, полученные в результате исследования, могут быть использованы при разработке средства для групповой профилактики и лечения начальных и средних стадий инфекционных болезней дистального отдела конечностей крупного рогатого скота.

Актуальные проблемы ветеринарной медицины, биотехнологии и морфологии: сборник трудов Национальной научно- практической конференции. – Кинель: Самарский ГАУ. – 2021. – С. 168–172.

Резюме

Цель исследования заключалась в определении антимикробной активности экспериментальных образцов средства для групповой профилактики и лечения инфекционных болезней дистального отдела конечностей крупного рогатого скота в отношении тест-микроорганизмов. Антимикробную активность экспериментальных образцов средства для сухих ножных ванн под шифрами «СВ», «СВ1» и «СВ2» в отношении тест-микроорганизмов: E. coli , S. aureus , Salmonella enterica , Cl. perfringens , F. necrophorum определяли согласно Руководству Р 4.2.3676-20 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфицирующих средств для оценки их эффективности и безопасности». Результаты экспериментов свидетельствуют, что образец под шифром «СВ» имеет наиболее выраженную антимикробную активность в отношении тест-микроорганизмов по сравнению с образцами «СВ1», «СВ2» и коммерческим препаратом «Любисан Эко» и является перспективным для дальнейших исследований.