Антимутагенная активность пробиотических культур и микробных консорциумов

Человек является частью природы. Влияние человека на окружающую среду всегда зависело от периода развития цивилизации, исторических и географических факторов. На текущем этапе развития прогресс сопровождается глобальными экологическими нарушениями и изменениями. Следует отметить, что происходит загрязнение окружающей среды факторами, не свойственными биосфере в норме, оказывающее отрицательное влияние на здоровье людей, и уже сейчас может нанести ущерб будущим поколениям. Антропогенное загрязнение мутагенами окружающей среды приводит к увеличению частоты мутаций у микроорганизмов, растений, животных и человека. Предотвратить накопление мутационного груза, способного вызвать «взрыв» мутабельности, и тем самым, сохранить наследственность, актуальная и непростая задача, стоящая перед человечеством [1].

Мутагенез можно рассматривать как случайный, в том смысле, что возникновение каждого мутационного события не может быть предсказано с точностью в пространстве или времени [2]. Неверно представление о том, что мутации возникают только под влиянием высокой дозы облучения (доказано, что нет генетически безвредной дозы такового) или химического мутагена. К ним приводят и сбои в обычной жизнедеятельности организма [3].

Мутационные механизмы изменяют ДНК различным образом, что приводит к генетическим паттернам, известным как мутационные сигнатуры. Происхождение мутаций позволяет разделить их на три категории:

• 1.    Прямое повреждение ДНК. Члены микробиоты могут продуцировать белки, молекулы и вторичные метаболиты, которые могут непосредственно вызывать повреждение ДНК. Эти продукты могут напрямую взаимодействовать с ДНК хозяина, тем самым мутируя ее.

• 2.    Повреждение ДНК, вызванное иммунными клетками.

• 3.    Диетическое взаимодействие. Рацион хозяина и микробиота кишечника неразрывно связаны. Диета является ключевым модулятором риска развития рака. В некоторых случаях взаимодействие микробиоты и диеты приводит к образованию генотоксических соединений, способных мутировать геном хозяина [4].

Канцерогенные вещества широко распространены во всей окружающей среде и, следовательно, также встречаются в пищевых продуктах. Некоторые из этих соединений встречаются в природе; некоторые из них образуются во время обработки, в том числе при приготовлении пищи. Задействованы различные механизмы, в том числе прямое воздействие на ДНК (генотоксичные канцерогены) [5]. Некоторые высокореактивные генотоксичные канцерогены способны напрямую связываться с ДНК, но большинство канцерогенов требуют метаболической активации [6]. Напротив, негенотоксичные (эпигенетические) канцерогены не взаимодействуют напрямую с ДНК, но вызывают онкологические заболевания другими механизмами [5].

Развитие рака у человека уже давно определяется взаимодействием двух ключевых этиологических факторов: генетики и воздействия окружающей среды. Однако появляется все больше доказательств того, что генетические факторы не могут быть основной причи- ной развития рака, но что воздействие природных и искусственных химических и физических канцерогенов может оказывать более глубокое воздействие [7]. В настоящее время наблюдается общемировая тенденция к интенсивному изучению антимутагенов как антиканцерогенов [8].

Микроорганизмы оказались особенно полезными объектами для экспериментальных исследований из-за их больших размеров популяции и короткого времени генерации, а также легкости, с которой можно манипулировать их средой и геномами. Экспериментальные исследования микробной эволюции подтвердили основные принципы эволюционной теории, а также дали новое представление о генетике, физиологии и экологии микроорганизмов [9].

Обширный репертуар микробов под общим названием микробиота вызывает повреждение ДНК и является драйвером для соматических мутаций. Некоторые (или, возможно, большинство) членов микробиома могут не взаимодействовать со своим хозяином, а вместо этого являются простыми пассажирами. Понимание мутационных механизмов, обусловленных микробиотой, будет способствовать более полному пониманию происхождения генома рака [10].

Микроорганизмы очень разнообразны и варьируются по эффекту от вредных до полезных. Некоторые из них ответственны за болезни растений и животных, в то время как другие играют важную роль в улучшении систем сельского хозяйства и производства продуктов питания и являются многофункциональными [11].

Для сохранения генома бактерии имеют надежные средства защиты: кроме системы репарации ДНК, они вырабатывают защиту путем синтеза веществ с протекторными, реактивирующими и антимутагенными свойствами, следовательно, могут оказывать положительный эффект для здоровья людей. Поэтому исследование антимутагенных свойств бактерий, которые присутствуют в пище и населяют организм человека, очень перспективно. Ведь, как известно, натуральные природные антимутагены обладают физиологичностью, а также высокой эффективностью и универсальностью.

В настоящее время изучение антимутагенности биопродуктов направлено на выявление новых штаммов, спектра их антимута- генного действия и возможных механизмов антимутагенеза.

Молочнокислые микроорганизмы и бифидобактерии являются одомашненными бактериями, ибо их применяют в самых разнообразных традиционных процессах пищевой ферментации, в том числе при изготовлении кисломолочных продуктов.

Использование пропионовокислых бактерий в качестве биологических антимутагенов имеет ряд преимуществ перед другими источниками. Антимутагенная активность пропионовокислых культур не ограничивается лишь их сорбционными свойствами, но может включать дополнительные, пока неустановленные механизмы антимутагенеза. Бактерии являются облигатными составляющими нормальной микрофлоры человека и широко применяются в медицине и биотехнологии.

Естественный микробиологический симбиоз кефирных грибков обуславливает образование стойкой микробной ассоциации, участвующей в создании здорового микробиоценоза, благотворно влияющего на здоровье человека и благоприятствующего замедлению старения организма. Механизмы антимута-генного действия микроорганизмов кефирной грибковой закваски пока не изучены, но имеются сведения, что грибковая закваска является природным естественным биоантимутагеном [12].

Общеизвестный факт, что ацидофильная палочка, вводимая в организм в виде кисломолочных продуктов, оказывает выраженный иммуномодулирующий эффект, проявляющийся в усилении фагоцитарной активности макрофагов, моноцитов и гранулоцитов, синтеза цитокинов (например, интерферона), стимуляции клеточных иммунных механизмов, включая противоопухолевую защиту.

Введение в рацион питания кисломолочных биопродуктов с использованием ацидофильной палочки и пропионовокислых бактерий в качестве антимутагенных факторов имеет важное значение для улучшения здоровья людей.

Цель исследования имеет многоплановый характер. На первом этапе создаются микробные композиции на основе ацидофильной палочки, кефирной культуры и пропионовокислых бактерий в определенном соотношении. В дальнейшем необходимо изучить их пробиотические свойства, в том числе антимута-генную активность. Подобный скрининг ори- ентирован на идентификацию пробиотических культур с высоким уровнем антимута-генного воздействия, и, несомненно, является преимуществом перед другими культурами и определяет их широкое практическое применение.

Количественное определение и актуальность тестов, которые измеряют мутагенез и канцерогенез, чрезвычайно сложны. Тест Эймса является наиболее широко используемым краткосрочным тестом на мутагенез и единственным краткосрочным тестом, который считается полностью валидированным. В нем рассматривается превращение мутантного штамма Salmonella typhimurium обратно в нативный штамм, поскольку химические вещества, которые увеличивают частоту возврата к нативному состоянию, с высокой вероятностью могут быть канцерогенными [13].

Объекты и методы исследований

Исследования проводились на базе кафедры «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» и малого инновационного предприятия ООО «МИП Бифивит» Института пищевой инженерии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления».

Объектами исследований в эксперименте служили пропионовокислые бактерии (ПКБ) Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii AC-2503, Propionibacterium freuden-reichii SH-85 , полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика», активизированные биотехническим методом, разработанным в ВСГУТУ; Lactobacillus acidophilus штамм вязкой расы ВНИМИ; кефирная грибковая закваска ОСТ 10-02-02-48.

В данном исследовании с целью определения антимутагенной активности применяли тест Эймса. В ходе эксперимента смешивали в равных пропорциях культуру Salmonella typhimurium, испытуемый мутаген и образец в качестве антимутагена. Полученную смесь выливали на поверхность минимальной ага-ризованной среды (нижнего агара) в чашки Петри и инкубировали в течение 48 ч при температуре 37 °С. Одновременно ставили позитивную контрольную пробу, в которой присутствовал мутаген, но не было антимутагена, и отрицательную контрольную пробу, в которой не было мутагена, но присутствовал потенциальный антимутаген. Общий объем смеси доводили до 0,4 мл с помощью 0,2 М фосфатного буфера рН 7,4. После инкубирования культуры производили подсчет ревер-тантов в чашках. Эксперименты ставили в трех повторностях и проводили статическую обработку данных.

Результаты и их обсуждение

Изучена антимутагенная активность пробиотических культур и консорциумов данных культур (рис. 1, 2). В дальнейшей работе полученные консорциумы будут использованы в технологии биологически активных добавок и бактериальных концентрированных заквасок.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее антимутагенно-активными оказались штаммы пропионовокислых бактерий, которые в сочетании с ацидофильной палочкой и кефирной грибковой закваской усиливают антимутагенный эффект.

Следует особо подчеркнуть, что значительный вклад в повышение антимутагенных свойств консорциумов вносят не только пропионовокислые бактерии, но и кефирная грибковая закваска и ацидофильная палочка, где наблюдается достаточно высокая степень ингибирования антимутагенных веществ. Ко-

■ Lactobacillus acidophilus

■ Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii AC-2503

■ Propionibacterium freudenreichii SH-85

■ кефирная грибковая закваска + Propionibacterium freundenreichii subsp. shermanii AC-2503

■ Propionibacterium freudenreichii SH-85 + Lactobacillus acidophilus

■ Кефирная грибковая закваска + Propionibacterium freudenreichii SH-85

Рис. 1. Результаты антимутагенной активности микроорганизмов и консорциумов (количество ревертантов)

Lactobacillus acidophilus + Propionibacterium freudenreichii SH-85

Кефирная грибковая закваска +

Propionibacterium freudenreichii SH-85 Кефирная грибковая закваска +

Propionibacterium freundenreichii subsp. …

70,5

67,5

69,3

Propionibacterium freudenreichii SH-85                                              65,6

Propionibacterium freundenreichii subsp.

shermanii AC-2503                                                    ^63,4

Lactobacillus acidophilus

50,9

Кефирная грибковая закваска

0    10   20    30   40    50    60   70    80

Ингибирование, %

Рис. 2. Результаты антимутагенной активности микроорганизмов и консорциумов (степень ингибирования)

личество продуцируемых антимутагенных веществ составляет у пропионовокислых бактерий более 60 %, у ацидофильной палочки – 50,9 %, у кефирной грибковой закваски – 39 %. Необходимо отметить, что совместное культивирование пробиотических микроорганизмов приводит к значительному росту ан-тимутагенной биоактивности.

Таким образом, исследованные штаммы пробиотических культур и их консорциумов проявили достаточно высокий уровень анти-мутагенной активности, что доказывает их выраженные пробиотические свойства и большую значимость в технологии пробиотических биологически-активных добавок и бактериальных концентратов.