Ассоциация генов HLA;DRB1 с развитием пароксизмальной ночной гемоглобинурии

Введение. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) представляет собой редкое клональное заболевание крови, характеризующееся хроническим внутрисосудистым гемолизом с рядом осложнений и наклонностью к рецидивирующим тромбозам. В основе заболевания лежит приобретенная соматическая мутация P A гена в гемопоэтических стволовых клетках, что приводит к появлению одного или нескольких ПНГ-клонов с нарушенным синтезом гликозил-инозитоловых ( P — g lycosylphosphatidylinositol) якорных структур, осуществляющих фиксацию на мембране клеток P -связанных протеинов, защищающих собственные эритроциты от агрессивного действия активированного комплемента и комплемент-зависимого лизиса. В настоящее время для выявления ПНГ-клона используется метод высокочувствительной проточной цитометрии (ПЦ) с использованием скрининговой панели с маркерами C 55 и C 59 (для ретикулоцитов и эритроцитов), C 24/FLAER (для гранулоцитов), C 14/FLAER (для моноцитов) [1; 2].

Для ПНГ характерно также наличие цитопении различной степени выраженности и нередко ассоциация с другими заболеваниями, связанными с костномозговой недостаточностью. По данным А. Д. Кулагина с соавторами моно-или билинейные цитопении встречаются у 2/3 больных с классической гемолитической ПНГ [3]. ПНГ-клон различной величины закономерно встречается также у определённой части больных апластической анемией (АА) (до 70 % больных) и миелодиспластическим синдромом (МДС) (10–25 %), реже — при других окогемато-логических заболеваниях [4; 5–7]. При этом размер клона может варьировать в широком диапазоне — от минорного клона до сочетанных вариантов АА/ПНГ, реже МДС/ПНГ с наличием признаков клинически значимого гемолиза и гемолитических кризов. Имеются многочисленные наблюдения, описывающие прогрессию с переходом АА в классическую гемолитическую ПНГ, сопровождающуюся нарастанием размера патологического клона, преимущественно при достижении ремиссии АА [8–11]. В то же время, имеются сведения о случаях выявлении ПНГ-клона небольшого размера без каких-либо клинических и лабораторных признаков патологии [12]. При этом большинство исследователей сходятся во мнении, что клинически значимым, как правило, является размер клона 10 % и более от общего числа клеток крови [8; 10; 13]

Несмотря на то, что молекулярно-генетические особенности и патогенетические механизмы ПНГ подробно изучены, отдельные аспекты остаются недостаточно освещенными. Так, нет ясности в понимании тесной связи данной патологии с другими синдромами костномозговой недостаточности и причин прогрессии с экспансией ПНГ-клонов. Высказывается обоснованное мнение о наличии внутренних факторов эволюции ПНГ-клона [14]. Определенное значение в развитии и прогрессии заболевания придается имму-нообусловленным механизмам. Если в патогенезе АА ведущим механизмом признается иммунообусловленная депрессия кроветворения, то в развитии ПНГ, по мнению ряда исследователей, играет роль иммунная атака и клональная экспансия через иммуноселекцию [15]. Значимым можно считать и утвердившееся в последние годы представление о том, что наличие ПНГ-клона у пациентов с АА является подтверждением иммуноо-посредованного заболевания и фактором, прогнозирующим положительный ответ на стандартную иммуносупрессивную терапию [16–18].

Роль иммунной системы в развитии ПНГ подтверждается обнаружением ассоциации между ПНГ и определенными аллельными вариантами генов Главного комплекса гистосовместимости (HLA-генов). Наиболее часто в литературе упоминается ассоциация развития ПНГ клона с определенными аллелями HLA-генов класса . В исследованиях, выполненных в разных популяциях — в Польше, Японии, Италии — была выявлена повышенная частота HLA- RB1*15:01, HLA- RB1*04:01 и гаплотипа RB1*15:01- QA1*01:02-

QB1*06: 02 [17–19]. В тоже время, есть сведения об особенностях HLA-генов класса при этом заболевании — среди итальянских пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией была выявлена повышенная частота гаплотипа HLA-B *14:02-C*08:02 [19]. В одноцентровом исследовании, выполненном в Польше, у пациентов с апластической анемией и наличием ПНГ клона была выявлена ассоциация с аллелем HLA-B*18:01, тогда как для аллеля HLA-A *24:02 установлена протективная роль [20]. При этом механизмы ассоциации аллелей Главного комплекса гистосовместимости с ПНГ остаются неясными. Возможно, это зависит от функциональных свойств определенных молекул Главного комплекса гистосовместимости.

Таким образом, полученные зарубежными исследователями данные свидетельствуют о возможной роли HLA-генов класса и класса в развитии ПНГ. При этом в РФ изучение особенностей распределения аллелей HLA-генов

Таблица 1.

Демографическая и клиническая характеристика пациентов

Количество пациентов	77
Медиана возраста, лет	42 (16–74)
Пол:
Мужской, чел. ( %)	31 (40,3 %)
Женский, чел. ( %)	46 (59,7 %)
Диагнозы направления
АА / ПНГ ( %)	55 (71,4 %)
ПНГ ( %)	16 (20,8)
МДС / ПНГ ( %)	6 (7,8 %)

В качестве популяционного контроля использовалась группа доноров крови, жителей европейской части России, из 1456 человек в возрасте от 18 до 60 лет: мужчин — 871 (59,8 %), женщин — 585 (40,2 %), выразивших добровольное согласие на проведение имму-ногенетического обследования для включения в регистр доноров костного мозга.

Диагностика наличия ПНГ-клона осуществлялась с помощью проточной цитометрии по общепринятой методике с использованием стандартного протокола, рекомендованного Международным Обществом Клинической Цитометрии ( CCS) [2].

ПНГ-клон определяли в периферической крови среди эритроцитов, гранулоцитов и моноцитов, используя проточный цитофлуориметр Beckman Coulter (США). Использовали следующий набор реагентов:для выяв- у пациентов с наличием ПНГ-клона не проводилось.

Целью настоящего исследования являлось изучение особенностей распределения HLA-RB1 аллелей у больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией (ПНГ), проживающих в европейской части России.

Материалы и методы. В исследование были включены 77 пациентов, образцы периферической крови которых направлялись в лабораторию иммуногематологии ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России из различных регионов европейской части России для выявления ПНГ-клона. Основными диагнозами направления были: апластическая анемия (АА), ПНГ, миелодиспластический синдром (МДС). У подавляющего большинства пациентов (71,4 %) диагнозом направления на обследование являлся АА/ПНГ. Демографическая и клиническая характеристика пациентов представлены в таблице 1 .

ления ПНГ клеток на эритроцитах — C 235a –F TC/ C 59-PE; на гранулоцитах — C 45-PC7/C 15-PC5/ C 24-PE/ FLAER-Alexa 488; на моноцитах — C 45-PC7/C 64-PC5/C 14-PE / FLAER-Alexa 488. Окрашивание лейкоцитов проводили по стандартной методике феноти-пирования для цельной крови, для моноцитов и гранулоцитов в разных пробирках: после добавления к образцу цельной крови антител в объеме, предлагаемом производителем, и 20-ти минутной инкубации в темноте проводили лизирование эритроцитов с последующей отмывкой. Для выявления эритроцитов с ПНГ-фенотипом, цельную кровь предварительно разбавляли в 100 раз, затем инкубировали с антителами в отдельной пробирке с последующей обязательной двойной отмывкой.

Для проведения HLA-типирования гена RB1 геномную ДНК выделяли из ядросо- держащих клеток периферической крови с использованием набора реагентов NA BOX 500 производства «Protrans» (Германия). HLA-типирование гена RB1 проводилось на уровне базового разрешения, т.е. выполнялось определение групп аллелей с помощью полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфичными праймерами (PCR-SSP) производства “Protrans” (Германия). В случае выявления группы аллелей HLA- RB1*15 выполнялось высокоразрешающее типиро-вание с помощью PCR-SSP с сиквенс-специ-фичными праймерами производства “Olerup” (Германия).

Статистическую обработку проводили при помощи пакета программ Arlequin software package, version 3.5. Достоверность различий определяли с помощью критерия χ 2 с поправкой Йейтса.

Результаты. На основании результатов, полученных с помощью проточной цитометрии, патологический клон среди гранулоцитов и/ или моноцитов был выявлен у 57 (74,03 %) обследованных лиц; у 20 (25,97 %) пациентов, направленных на обследование, ПНГ-клон не был обнаружен.

Величина ПНГ-клона варьировала от 0,1 % до 99,9 %, при этом клинически значимым считали клон более 10 %, т. н. «большой клон», а содержание клеток с ПНГ-фенотипом от 0,1 до 10 % расценивали как «малый клон». Большой клон был определен у 41 человека (73,2 %), малый клон — у 16 человек (26,8 %).

По результатам иммуногенетического обследования (HLA-типирования) определено, что из 13 установленных в настоящее время групп аллелей HLA- RB1 в общей группе пациентов с наличием ПНГ-клона выявлены практически все, за исключением групп HLA-

RB1*10 и HLA- RB1*12, что объясняется достаточно редкой их частотой у жителей европейской части нашей страны. Анализ распределения групп аллелей показал, что среди пациентов с наличием ПНГ-клона значительно повышена частота группы аллелей HLA- RB1*15–66,07 % против 28,37 % в группе контроля (таблица 2) .

Частота групп аллелей HLA-DRB1 у пациентов с наличием ПНГ-клона

Таблица 2.

Группы аллелей	Частота в группе пациентов с ПНГ клоном ( %), n = 57	Частота в группе популяционного контроля ( %), n = 1456	χ 2	р
HLA-DRB1*01	10,53	23,70	6,10	< 0,005
HLA-DRB1*03	21,05	16,28	0,70	> 0,05
HLA-DRB1*04	17,54	20,40	0,40	> 0,05
HLA-DRB1*07	21,05	25,69	0,76	> 0,05
HLA-DRB1*08	1,75	5,91	2,53	> 0,05
HLA-DRB1*09	3,51	2,47	0,01	> 0,05
HLA-DRB1*10	0,00	1,79	2,35	> 0,05
HLA-DRB1*11	22,81	22,94	0,01	> 0,05
HLA-DRB1*12	0,00	3,85	3,45	> 0,05
HLA-DRB1*13	19,30	25,00	1,14	> 0,05
HLA-DRB1*14	5,26	3,16	0,28	> 0,05
HLA-DRB1*15	64,91	28,37	34,89	< 0,0001
HLA-DRB1*16	1,75	8,65	4,26	< 0,005

При последующем высокоразрешающем типировании группы аллелей HLA- RB1*15 установлено, что в 100 % случаев в этой группе аллелей определялся HLA- RB1*15:01.

На фоне столь значимого увеличения частоты HLA- RB1*15:01 у пациентов с наличием ПНГ-клона установлено достоверное снижение частоты групп аллелей HLA- RB1*01–10,75 % против 23,7 % и HLA-

RB1*16–1,75 % против 8,65 % по сравнению с группой здоровых лиц.

У пациентов с отсутствием ПНГ-клона также было установлено 11 групп аллелей HLA- RB1 (не выявлены HLA- RB1*09 и HLA-

RB1*12). Распределение групп аллелей гена HLA - RB1 незначительно отличалось от такового в группе популяционного контроля за исключением группы аллелей HLA- RB1*14, частота которой существенно превосходила с большой разницей в численности обследо-частоту в контрольной группе: 20 % против ванных групп.

3,16 % (таблица 3) , что может быть связано

Частота групп аллелей HLA-DRB1 у пациентов с отсутствием ПНГ-клона

Таблица 3.

Группы аллелей	Частота в группе пациентов без ПНГ клона ( %), n = 20	Частота в группе популяционного контроля ( %), n = 1456	χ 2	р
HLA-DRB1*01	15,00	23,70	1,38	> 0,05
HLA-DRB1*03	10,00	16,28	1,13	> 0,05
HLA-DRB1*04	10,00	20,40	2,04	> 0,05
HLA-DRB1*07	15,00	25,69	1,81	> 0,05
HLA-DRB1*08	5,00	5,91	0,42	> 0,05
HLA-DRB1*09	0,00	2,47	2,08	> 0,05
HLA-DRB1*10	5,00	1,79	0,05	> 0,05
HLA-DRB1*11	25,00	22,94	0,00	> 0,05
HLA-DRB1*12	0,00	3,85	2,20	> 0,05
HLA-DRB1*13	30,00	25,00	0,06	> 0,05
HLA-DRB1*14	20,00	3,16	12,34	< 0,05
HLA-DRB1*15	45,00	28,37	1,92	> 0,05
HLA-DRB1*16	5,00	8,65	0,79	> 0,05

В этой группе пациентов высокоразрешающее типирование группы аллелей HLA-RB1*15 также выявило HLA- RB1*15:01 в 100 % случаев.

Изучение частоты групп аллелей HLA-RB1 среди пациентов в зависимости от величины патологического клона не показало каких-либо значимых различий (таблица 4). Однако необходимо отметить, что в группе пациентов с малым ПНГ-клоном не выявлено лиц, имеющих в генотипе HLA- RB1*01, а частота HLA- RB1*15:01 существенно превосходила таковую в группе пациентов с большим ПНГ-клоном (81,25 % против 58,54 %).

Таблица 4.

Группы аллелей/ аллель	Частота в группе пациентов с большим ПНГ клоном ( %), n = 41	Частота в группе пациентов с малым клоном ПНГ клоном ( %), n = 16	χ 2	р
HLA-DRB1*01	14,63	0,00	1,29	> 0,05
HLA-DRB1*03	19,51	25,00	0,67	> 0,05
HLA-DRB1*04	17,07	18,75	0,29	> 0,05
HLA-DRB1*07	19,51	25,00	0,67	> 0,05
HLA-DRB1*08	0,00	6,25	3,49	> 0,05
HLA-DRB1*09	2,44	6,25	2,26	> 0,05
HLA-DRB1*10	0,00	0,00	-
HLA-DRB1*11	29,27	12,50	0,96	> 0,05
HLA-DRB1*12	0,00	0,00	-
HLA-DRB1*13	21,95	12,50	0,19	> 0,05
HLA-DRB1*14	4,88	6,25	0,75	> 0,05
HLA-DRB1*15:01	58,54	81,25	3,70	> 0,05
HLA-DRB1*16	4,88	6,25	0,75	> 0,05

Частота групп аллелей HLA-DRB1 у пациентов с ПНГ-клоном в зависимости от величины клона

Изучение частоты групп аллелей HLA- RB1 у пациентов с выявленным ПНГ-клоном в зависимости от диагноза (АА, МДС, ПНГ) показало, что наибольшая частота HLA- RB1*15:01 наблюдалась в группе больных с АА (73,53 %), несколько реже этот аллель определялся у пациентов с МДС (62,5 %) и ПНГ (53,33 %), однако во всех группах больных частота аллеля HLA- RB1*15:01 существенно превышала этот показатель в группе популяционного контроля (таблица 5).

Таблица 5.

Частота групп аллелей HLA-DRB1 у пациентов с ПНГ-клоном в зависимости от диагноза

Группы аллелей/аллель	Частота в группе пациентов с АА ( %), n = 34	Частота в группе пациентов МДС ( %), n = 8	Частота в группе пациентов ПНГ ( %), n = 15
HLA-DRB1*01	5,88	12,50	20,00
HLA-DRB1*03	20,59	12,50	26,67
HLA-DRB1*04	8,82	25,00	33,33
HLA-DRB1*07	29,41	12,50	6,67
HLA-DRB1*08	2,94	0,00	0,00
HLA-DRB1*09	5,88	0,00	0,00
HLA-DRB1*10	0,00	0,00	0,00
HLA-DRB1*11	32,35	12,50	13,33
HLA-DRB1*12	0,00	0,00	0,00
HLA-DRB1*13	5,88	37,50	40,00
HLA-DRB1*14	0,00	12,50	6,67
HLA-DRB1*15:01	73,53	62,50	53,33
HLA-DRB1*16	5,88	12,50	0,00

Заключение. В ходе выполненной работы нами впервые получены данные о распределении частот групп аллелей гена HLA- RB1 у больных с установленным методом проточной цитометрии ПНГ-клоном, проживающих на территории европейской части России.

Установлено, что частота иммуногенетиче-ского маркера HLA- RB1*15:01 значимо повышена как в группе больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией, так у больных АА/ПНГ и МДС/ПНГ, что согласуется с данными других авторов о сильных ассоциативных связях аллеля HLA- RB1*15:01 с развитием ПНГ-клона [18–22]. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что клональная селекция гемопоэтических стволовых клеток с мутацией P A гена ассоциирована именно HLA- RB1*15:01. В тоже время, согласно результатам наших исследований, наличие

RB1*15:01 не является фактором, определяющим величину патологического клона т. к. у пациентов как с большим, так и с малым клоном с высокой частотой выявлялся этот аллель. К протективным иммуногенетиче- ским факторам развития ПНГ-клона, согласно результатам наших исследований, можно отнести такие иммуногенетические маркеры, как HLA- RB1*01 и HLA- RB1*16.

Несмотря на то, что в настоящее время для диагностики ПНГ-клона успешно применяется стандартный протокол с использованием проточной цитометрии, полученные нами новые сведения об иммуногенетических маркерах развития ПНГ-клона можно использовать в качестве дополнительных критериев дифференциальной диагностики, особенно в случаях выявления минорного клона ПНГ.

Учитывая тот факт, что по данным некоторых зарубежных авторов развитие ПНГ-клона ассоциировано с определенными генами HLA не только класса , но и класса , представляется интересным продолжить эту работу и провести иммуногенетическое обследование, включающее изучение аллелей генов HLA как класса (HLA-A, B, C), так и класса (HLA- QB1, QA1) пациентов с ПНГ-клоном, проживающих на территории европейской части РФ.

Конфликты интересов отсутствует

Источник финансирования

Исследование не имело источника финансирования