Цитологические и биохимические изменения бронхоальвеолярной лаважной жидкости у самок крыс при остром воздействии микрочастиц полистирола

Введение. Микропластик признается приоритетным загрязнителем окружающей среды, однако в настоящее время фактические данные о связанных с ним рисках остаются ограниченными и неоднозначными. В экотоксикологиче-ском контексте опасность, которую микропластик представляет для экосистем и здоровья организмов, остается неопределенной, а имеющиеся доказательства зачастую носят фрагментарный характер [1]. Согласно докладам Всемирной организации здравоохранения в 2019 г.

и 2022 г., несмотря на повсеместное обнаружение микропластика в объектах окружающей среды, достоверные данные о его специфическом вреде для здоровья человека остаются ограниченными [2, 3]. Результаты исследований на животных зачастую невоспроизводимы и методологически неоднородны [2, 3], что серьезно затрудняет оценку потенциального риска от воздействия этого фактора. Восполнение данного пробела требует проведения исследований с использованием проверенных, стандартизированных методов, одним из которых является выполнение бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), позволяющего оценить реакцию альвеолярной поверхности легких на воздействие частиц. Эффективность и информативность БАЛ подтверждается его активным применением как зарубежными [4–6], так и отечественными [7, 8] научными коллективами. Это чувствительный и менее инвазивный, по сравнению с другими, метод, предоставляющий возможность исследовать как клеточный состав, так и растворимые компоненты в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ) при оценке токсичности веществ, включая частицы и наноматериалы [9]. Метод включен в перечень обязательных исследований для количественной оценки риска вдыхания аэрозолей, включая наноматериалы, пыли, частицы субмикронного диапазона [10].

Цель исследования. Оценить изменение цитологических и биохимических параметров бронхоальвеолярной лаважной жидкости при остром однократном воздействии микрочастиц полистирола размером 300 нм в эксперименте.

Материалы и методы. В исследовании были использованы самки крыс линии Wistar, приобретенные в питомнике «Рапполово». Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях при постоянной температуре воздуха (20–25 ℃), контролируемой влажности и освещенности. Уход осуществлялся в соответствии с действующими нормативными документами Российской Федерации. Все эксперименты проводились в соответствии с Директивой Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22.09.2010 о защите животных, используемых для научных целей. Исследование одобрено локальным биоэтическим комитетом (протокол № 01-1 от 22.01.2025).

Животные (n=14), масса тела которых на начало работы составила 170–220 г, а возраст – 10–12 нед., были случайным образом разделены на 2 группы по 7 особей в каждой. Крысы содержались в стандартных условиях, были сопоставимы по возрасту и массе тела, что обеспечивало исходную однородность выборок и минимизировало вариабельность, обусловленную биологическими факторами. Все манипуляции (инстилляция, забор БАЛЖ, эвтаназия) выполнялись в одно и то же время суток. Исследование носило характер острой модели (24 ч), ориентированной на оценку локального раннего ответа дыхательных путей, но не системного эффекта. Стадия эстрального цикла на момент воздействия не определялась; возможное влияние гормонального статуса на параметры воспалительного ответа рассматривается как ограничение исследования.

Первая группа являлась контрольной и получала вещество-носитель (деионизированную воду) в объеме 0,3 мл. Вторая группа подвергалась однократному воздействию микрочастиц полистирола (МП) размером 300 нм: интратрахеально вводили 25 мкл 2,5 % суспензии МП в дистиллированной воде, доведенной до конечного объема 0,3 мл. Гомогенизацию суспензии осуществляли непосредственно перед введением, которое осуществляли под эфирным наркозом согласно методике, описанной Kalidhindi et al. [11]. Через 24 ч выполняли забор БАЛЖ. Золетил-ксила-зиновый наркоз проводился ветеринарными специалистами. Полученную от каждого животного жидкость собирали в центрифужные пробирки и немедленно охлаждали (+4 °С) до завершения забора у всей серии.

Подсчет общей клеточности проводили в камере Горяева после 5-минутной инкубации 15 мкл клеточной суспензии с равным объемом 0,4 % трипанового синего. Подсчет осуществляли в 25 больших квадратах с соблюдением правила Егорова.

БАЛЖ центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 мин; надосадочную жидкость переносили в новые пробирки и хранили при -70 °С (без повторных циклов замораживания/размо-раживания) до анализа. Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), гамма-глутами-лтранспептидазы (ГГТП), а также концентрацию общего белка и альбумина изучали с помощью наборов реагентов «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия) на анализаторе Stat Fax 3300 (Awareness Technology, США) в соответствии с инструкциями производителя. Осадок клеток использовали для приготовления наливных мазков, которые окрашивали по Май-Грюнвальду согласно стандартной методике; далее выполняли дифференциальный подсчет клеток при ×100 с масляной иммерсией.

Для статистической обработки применяли пакет SciPy (Python 3.10) и метод Bootstrap. Различия признавали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение. Показано, что число клеток в жидкости, полученной при БАЛ через 24 ч после интратрахеального введения крысам МП, оказалось несколько выше, чем после введения среды-носителя, но различие не достигло статистической значимости: 2,02±0,48 против 1,74±0,38 (р=0,303). Однако наблюдаемая тенденция может указывать на развитие слабовыраженной клеточной реакции на поверхности альвеол в ответ на введение МП.

По данным литературы, диагностическую ценность в оценке воспалительного от- вета представляет не столько общая клеточ-ность БАЛЖ, сколько ее дифференциальный состав. Описаны случаи, когда на фоне стабильного общего числа клеток наблюдался выраженный нейтрофильный сдвиг, что расценивается как признак цитотоксического действия [12–14].

В наливных мазках БАЛ при подсчете доли клеток разных типов в опытной группе обнаружено снижение доли макрофагов (86,1±4,8 против 92,6±2,3, р=0,007) за счет увеличения доли нейтрофилов (7,15±3,01 против 3,96±1,98, р=0,034) и лимфоцитов (6,6±3,1 против 3,0±0,8, р=0,021). Эозинофилов и базофилов при оценке наливных мазков обнаружено не было. Изменения визуализированы на рис. 1. Индекс соотношения нейтрофилов и макрофагов в опытной группе был выше, чем в контрольной: 0,155±0,072 против 0,039±0,028 (р=0,007).

Рис. 1. Цитологические параметры БАЛЖ: доля макрофагов (а), нейтрофилов (б), лимфоцитов (в). Горизонтальные линии указывают на статистически значимые различия, выявленные методом Bootstrap (10 000 перестановок)

Fig. 1. Cytological parameters of bronchoalveolar lavage fluid: proportion of macrophages (a), neutrophils (b), and lymphocytes (c). Horizontal lines indicate statistically significant differences identified by the Bootstrap method (10,000 permutations)

Обнаруженный сдвиг цитологического профиля соответствует ответу легочной ткани на частицы субмикронного диапазона, которые не могут быть быстро фагоцитированы и элиминированы. При этом признаков гибели макрофагов не наблюдается: математический расчет абсолютного количества клеток подтвердил, что снижение доли макрофагов носило относительный характер, их абсолютное число в группе воздействия не имело достоверных отли-

чий от контроля. В то же время абсолютное количество нейтрофилов и лимфоцитов достоверно увеличилось, что свидетельствует об активном притоке этих клеток в альвеолярное пространство. Рост числа нейтрофилов, вероятно, опосредован хемотаксическими факторами, секретируемыми альвеолярными макрофагами при попытке фагоцитоза частиц. Увеличение доли лимфоцитов может указывать на вовлечение адаптивного иммунного ответа или ак-

тивацию специфических лимфоцитарных популяций, ассоциированных со слизистыми оболочками. Подобные изменения были описаны ранее, в т.ч. при воздействии наночастиц [15–17].

Для получения комплексной оценки выраженности воспалительного процесса в легочной ткани, наряду с цитологическими показателями, были проанализированы биохимические параметры надосадочной жидкости БАЛ. Полученные результаты (рис. 2) демонстрируют отсутствие статистической значимости изменения активности АЛТ (р=0,573), АСТ (р=0,493), ЛДГ (р=0,240), ГГТП (р=0,506). Не изменилась и концентрация общего белка (р=0,826). Вместе с тем активность ЩФ зафиксирована на уровне, превышающем контрольные значения (р=0,0416).

Полученные данные согласуются с современными представлениями о патофизиологии легочного ответа на ингаляцию инертных частиц: ЩФ считается индикатором активации и пролиферации альвеолярных эпителиоцитов II типа, а ее повышение отражает процессы адаптации и ремоделирования альвеолярного эпителия в условиях раздражения клеток [18–20], а кроме того, может быть связано с дегрануляцией прибывших нейтрофилов, которые являются известным источником этого фермента. Стабильные уровни активности АСТ, АЛТ, ЛДГ и общего белка свидетельствуют об отсутствии выраженного цитолиза клеток и существенного нарушения проницаемости альвеолярно-капиллярного барьера [21].

г/d

а/a

Контроль/ б/b в/c д/e е/f контроль / Control

Контроль/ Control

Контроль/ Control

Рис. 2. Биохимические параметры надосадочной жидкости БАЛ: активность АЛТ (а), АСТ (б), ЛДГ (в), ЩФ (г), ГГТП (д) и концентрация общего белка (е). Точки на графиках отражают индивидуальные наблюдения. Горизонтальные линии указывают на статистически значимые различия, выявленные методом Bootstrap (10 000 перестановок)

Fig. 2. Biochemical parameters of the bronchoalveolar lavage fluid supernatant: alanine aminotransferase activity, U/L (a); aspartate aminotransferase, U/L (b); lactate dehydrogenase, U/L (c); alkaline phosphatase, U/L (d); γ-glutamyltransferase, U/L (e); and total protein concentration, g/L (f). Points denote individual observations. Horizontal lines indicate statistically significant differences identified by the bootstrap method (10,000 resamples)

В совокупности обнаруженные нами изменения указывают на преимущественное развитие субклинической эпителиальной реакции,

но не на острую цитотоксичность по отношению к альвеолярным макрофагам или массивное клеточное повреждение [22, 23]. В настоя-

щей работе, несмотря на возможную гормональную вариабельность, эффект имел согласованное направление на уровне группы и сопровождался ограниченной внутригрупповой вариабельностью показателей. Вместе с тем отсутствие явных признаков токсичности не означает, что МП безопасны. Полученные данные не снимают ключевой неопределенности, обозначенной научным сообществом в оценке рисков ингаляционного воздействия микропластика. Обсуждается роль белковосурфактантной короны, формы и размерности частиц, химии полимера (в особенности при его старении), адсорбции на поверхности частицы различных примесей [24–26].

Кроме того, интерпретацию результатов следует проводить с учетом ограничений исследования. Во-первых, анализировалось влияние высокой дозы частиц, что не полностью соответствует реальным условиям воздействия низких доз МП на человека. Во-вторых, проводилась только острая оценка, что не отражает эффект хронического действия. В-третьих, изучались частицы одного типа, размера, с одинаковыми поверхностными свойствами, в то время как спектр микропластика в окружающей среде крайне разнообразен.

Главным же ограничением исследования является отсутствие стратификации животных по стадии эстрального цикла. Известно, что эстрогены способны модифицировать миграцию

нейтрофилов и профиль провоспалительных медиаторов, потенциально влияя на выраженность клеточного ответа. Для уточнения вклада гормонального статуса целесообразно проведение исследований с учетом стадии эстрального цикла и/или с экспериментальной модификацией гормонального фона (овариэктомия, определение эстрадиола/прогестерона) и расширением панели воспалительных маркеров.

Заключение. Таким образом, было показано, что однократное интратрахеальное введение микрочастиц полистирола размером 300 нм вызывает в легких самок крыс статистически значимый нейтрофильно-лимфоцитарный сдвиг при отсутствии маркеров массивного цитолиза. Изменения соответствуют картине раннего неспецифического ответа дыхательных путей на инертные частицы, описанной в экспериментальных моделях для других типов субмикронных частиц.

Отсутствие доказанных токсических эффектов в рамках данной экспериментальной модели не может однозначно свидетельствовать о безопасности изученных микрочастиц. Полученные результаты указывают на необходимость дальнейших исследований, направленных, например, на изучение возможных эффектов при сочетанном воздействии с загрязнителями среды обитания, способными сорбироваться на поверхности частиц и поступать в организм в виде комплексного соединения.

Исследование было выполнено в рамках отраслевой научно-исследовательской программы Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования: Рябова Ю.В., Каримов Д.О.

Литературный поиск, участие в исследовании, обработка материала: Хмель А.О.,

Смолянкин Д.А., Дюдьбин О. В.

Статистическая обработка данных: Каримов Д.О.

Анализ и интерпретация данных: Рябова Ю.В., Каримов Д.О., Базекин Г.В.

Написание и редактирование текста: Рябова Ю.В., Каримов Д.О.