Диагностические возможности молекулярного ПАП-теста у женщин репродуктивного возраста

Антонова Ирина Борисовна – д.м.н. заведующая лабораторией комплексной диагностики и лечения заболеваний мочеполовой и репродуктивной систем у взрослых и детей Научноисследовательского отдела хирургии, урологии, гинекологии и инвазивных технологий в онкологии ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, ORCID:

Ивашина Светлана Вячеславовна – к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории комплексной диагностики и лечения заболеваний мочеполовой и репродуктивной систем у взрослых и детей Научно-исследовательского отдела хирургии, урологии, гинекологии и инвазивных технологий в онкологии ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, ORCID:

Federal State Budgetary Institution "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the

Ministry of Healthcare of the Russian Federation (RSCRR), Moscow 117997, Profsoyuznaya, 86 Authors

Bliznyukov О.Р. – Doctor of Medical Sciences, Head of the Pathology Department of the FSBI

“Russian Scientific Center of Roentgenoradiology” of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, ORCID:

Введение

В структуре онкологической заболеваемости женщин Российской Федерации рак шейки матки в 2020 году занимает пятое место (5,2%). При этом в возрастной группе 30–39

лет основными причинами смерти у женщин являются опухоли шейки матки (21,3%) [1]. Рак шейки матки в стадии in situ диагностирован в 2021 г. только в 33,6 случаев на 100 впервые выявленных злокачественных новообразований шейки матки [2].

В настоящее время в патологии эпителия шейки матки преобладают повреждения, вызванные вирусом папилломы человека (ВПЧ), и его опухолевые последствия. Однако, значительная часть карцином шейки матки, особенно, аденокарцином, не связана с ВПЧ. Причем, ВПЧ-независимые карциномы шейки матки, как правило, более агрессивны, чем ВПЧ-ассоциированные карциномы [3].

В литературе отмечается значение определения экспрессионных профилей мРНК различных генов для медицинской сортировки пациенток с предраковыми процессами шейки матки и определения риска прогрессии патологического процесса в практике жидкостной цитологии у женщин репродуктивного возраста [4].

Цель исследования: улучшение диагностики предраковых процессов и рака шейки матки у пациенток репродуктивного возраста на основе оценки экспрессии 24-генной панели мРНК методом количественной ПЦР по материалу консервирующего раствора Пап-теста CellPrep.

Материалы и методы

Ретроспективно проанализированы результаты Пап-теста CellPrep (Biodyne Co., LTD, Корея) 180 пациенток репродуктивного возраста (от 20 до 45 лет), средний возраст 35,21±6,51 лет (M±SD, где M - среднее, SD - среднеквадратичное отклонение) проходивших лечение в ФГБУ <<РНЦРР>> Минздрава России в 2015 - 2022 гг. На начальном этапе во всех случаях выполнено исследование тонкослойных цитологических препаратов. Результаты цитологических исследований Пап-теста были представлены согласно классификации Bethesda [5]. Гистологические исследования оценивались по классификации опухолей женской половой системы (ВОЗ, 2014 г.) [6]. В таблице 1 отражено распределение пациенток в зависимости от гистологического диагноза и возраста.

Таблица 1. Распределение пациенток в зависимости от типа гистологических заключений и возраста

Гистологический диагноз	n – число пациенток; средний возраст (M±SD) * лет
Доброкачественные изменения	n=69; 35,78 ± 6,61
LSIL	n=16; 30,38 ± 7,64
HSIL	n=84; 35,37 ± 6,10
Плоскоклеточный рак	n=8; 36,75 ± 4,65
Аденокарцинома эндоцервикального типа	n=3; 39,00 ±4,36

*M – среднее, SD – среднеквадратичное отклонение; LSIL (плоскоклеточное интраэпителиальное поражение низкой степени), HSIL (плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени).

Методом количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием набора реагентов для определения профиля экспрессии генов с целью оценки прогностического индекса рецидивирования рака молочной железы методом ОТ-ПЦР (Глобал Индекс РМЖ) (регистрационное удостоверение от 27.02.2019  № РЗН 2019/8152) в материале консервирующего раствора Пап-теста CellPrep определены уровни экспрессии мРНК 21 гена: Ki-67, STK-15, CCNB1, CCND1, MYC, MYBL2, P16INK4A, PTEN, BIRC5, BCL2, BAG1, TERT, NDRG1, ESR1, PGR, HER2, GRB7, MGB1, MMP11, CTSL2, CD68 и 3 референсных генов: GUSB,HPRT1, B2M [7].

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием метода дискриминантного анализа в программном комплексе Statistica 7.0 (Stat Soft, США). Результаты

После выполнения Пап-теста CellPrep у всех 180 (100%) пациенток репродуктивного периода в материале остаточной жидкости консервирующего раствора методом количественной ПЦР определены уровни экспрессии мРНК 24 исследуемых генов, аналогично результатам, полученным ранее (Табл. 2) [7].

Таблица 2. Сравнение уровней экспрессии исследованных генов в группах с гистологически подтвержденными доброкачественными изменениями и LSIL, а также не менее, чем HSIL, включая HSIL, плоскоклеточный рак и эндоцервикальную аденокарциному

Функциональная группа	Ген в панели	Доброкачественные (неопухолевые) изменения и LSIL M-среднее, N=85	HSIL+ M-среднее, N=95
Пролиферация	KI67	2185,6	6489,7
	STK15	23,0	46,1
	CCNB1	38,3	90,5
	PTEN	6,4	4,5
	CCND1	34,6	27,1
	P16INK4A	80,4	23,1
	MYC	17,2	25,1
Апоптоз	BCL2	8,8	8,6
	BAG1	6,8	5,9
	NDRG1	834,2	2193,1
	BIRC5	13,9	28,4
	TERT	10,9	73,2
Клеточные рецепторы и другие маркеры	ESR1	108,8	84,8
	PGR	1316,6	538,0
	HER2	16,3	33,2
	GRB7	16,0	22,5
	MGB1	709049,7	355218,1
Протеиназы	ММР11	5423,1	3959,4
	CTSL2	709049,7	355218,1
Маркеры активированных макрофагов	CD68	12,7	10,0

По данным дискриминантного анализа установлено, что сочетанная оценка экспрессии 21 целевого гена позволяет провести правильную классификацию группы, объединяющей LSIL и доброкачественные изменения в 90,59% случав. Для пациенток группы HSIL+, объединяющей HSIL, плоскоклеточный рак, эндоцервикальную аденокарциному, точная классификация возможна в 78,95% случаев. Суммарная точность классификации составила 84, 44%. случаев.

Подробный анализ дискриминантных функций выявил наибольший вклад в точную классификацию оценку уровней экспрессии пяти генов: CTSL2, PTEN, PGR, STK15, p16INK4a (Табл. 3).

Таблица 3. Итоги анализа дискриминантных функций гистологически подтвержденных диагностических категорий для групп: доброкачественные изменения и LSIL, не менее, чем HSIL

Ген	Лямбда Уилкса	Частная Лямбда	F-исключение (1.158)	P-значение	Толерантность	1- толерантность (R-кв.)
MGB1	0,616955	0,983453	2,65838	0,104997	0,787460	0,212540
CTSL2	0,626255	0,968850	5,08003	0,025578	0,200853	0,799147
BCL2	0,606754	0,999988	0,00190	0,965266	0,755568	0,244432
MYC	0,607988	0,997958	0,32336	0,570403	0,408137	0,591863
BIRC5	0,606823	0,999874	0,01991	0,887972	0,225360	0,774640
CCND1	0,612602	0,990442	1,52472	0,218740	0,520410	0,479590
NDRG1	0,607491	0,998775	0,19379	0,660379	0,588990	0,411010
CD68	0,619218	0,979860	3,24754	0,073437	0,231278	0,768722
KI67	0,606806	0,999902	0,01552	0,901015	0,118587	0,881413
TERT	0,609205	0,995966	0,64003	0,424900	0,938654	0,061347
HER2	0,607855	0,998177	0,28855	0,591905	0,832364	0,167636
PTEN	0,638230	0,950671	8,19849	0,004762	0,573085	0,426916
BAG1	0,611288	0,992571	1,18264	0,278476	0,398461	0,601539
PGR	0,626161	0,968995	5,05550	0,025931	0,466569	0,533431
CCNB1	0,606765	0,999971	0,00465	0,945707	0,342313	0,657687
ESR1	0,612831	0,990071	1,58448	0,209973	0,425495	0,574505
GRB7	0,611882	0,991607	1,33733	0,249251	0,169955	0,830045
MMP11	0,608692	0,996804	0,50663	0,477653	0,571001	0,428999
STK15	0,627169	0,967437	5,31812	0,022404	0,249747	0,750253
MYBL2	0,608673	0,996835	0,50175	0,479777	0,182585	0,817415

P16INK4A 0,678547 0,894186 18,69710    0,000027 0,454181       0,545819

Лямбда Уилкса: 0,60675 прибл. F (21,158) )=4,8764 P< 0,0000. Жирным шрифтом выделены гены, вносящие наибольший вклад в правильность классификации.

Максимальным влиянием на точность классификации обладает возрастание уровня экспрессии гена p16INK4a в случае тяжелых патологических изменений шейки матки – HSIL+ (Рис. 1).

Во«plot by Grom Variable. P16INK4A

Рис. 1. Сравнительная оценка уровней экспрессии мРНК в группах гистологически подтвержденных LSIL или менее (неизмененный эпителий/доброкачественные изменения тканей шейки матки) и HSIL+.

Обсуждение

Тенденция настоящего времени – изучение возможностей дополнительного тестирования в практике молекулярного Пап-теста [8]. В отечественной литературе приводятся сведения о разработке способа выявления дисплазии тяжелой степени на основе оценки экспрессии уровня мРНК 11 генов методом ПЦР в режиме реального времени по материалу транспортной среды для жидкостной цитологии BD Sure Path [4].

Впервые в отечественной литературе нами сообщалось о возможности дифференцировать две клинически значимые группы пациентов: HSIL+ и LSIL/доброкачественные изменения ткани шейки матки на основе оценки экспрессии панели из 21 генов в практике Пап-теста CellPrep [7].

В настоящей работе впервые для женщин репродуктивного периода по материалу консервирующего раствора Пап-теста CellPrep проанализировали возможности оценки 21

целевого гена теста Глобал Индекс РМЖ в дифференциальной диагностике двух клинически значимых групп: доброкачественные изменения и LSIL, а также HSIL+. Установлено, что в репродуктивном возрасте сочетание экспрессии генов CTSL2, PTEN, PGR, STK15, p16INK4a в наибольшей степени определяет правильность классификации, а для менопаузы целевым сочетанием ранее нами выявлена комбинация 6 генов: CTSL2, BIRC5, BAG1, PGR, CCNB1, MMP11 [9].

Белок p16, продукт гена p16INK4a (CDKN2A), играет важную роль в качестве ингибитора циклинзависимой киназы в опосредованном белком ретинобластомы контроле клеточной прогрессии и дифференцировки. В практике иммуногистохимического исследовавния p16INK4a используется в качестве маркера при интерпретации степени поражения шейки матки. Установлено, что определение уровня экспрессии гена p16INK4a в материале консервирующей жидкости Пап-теста CellPrep для женщин репродуктивного периода в дифференциальной диагностике группы с гистологическим подтверждением LSIL или менее (неизмененный эпителий/доброкачественные изменения тканей шейки матки) с группой HSIL+ по данным дискриминантного анализа обладает наибольшим диагностическим потенциалом, что согласуется с результатами предыдущих наших исследований – достоверно более высокий уровень экспрессии мРНК гена р16INK4a был отмечен в группе цервикальных интраэпителиальных неоплазий в отличие от неизмененного эпителия шейки матки [10].

Заключение

В группе женщин репродуктивного возраста по материалу консервирующего раствора Пап-теста CellPrep при помощи оценки экспрессии 21 целевого гена, разработанного для теста Глобал Индекс РМЖ, возможно идентифицировать с точностью 84,44% две клинически важные группы: LSIL или менее (неизмененный эпителий/доброкачественные изменения тканей шейки матки) и не менее, чем HSIL (HSIL, плоскоклеточный рак, эндоцервикальная аденокарцинома). Анализ экспрессии мРНК исследованных генов может претендовать на роль теста медицинской сортировки в скрининге рака шейки матки как этап молекулярного Пап-теста.