Динамика показателей клеточного иммунитета в процессе аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с множественной миеломой

Введение. Множественная миелома ассоциирована с развитием иммунодефицитного состояния и представляет собой заболевание с опухолевым поражением В-клеточного иммунитета, следствием чего является уменьшение численности нормальных антителопродуцирующих клеток [1]. Известно, что восстановление Т-лимфоцитов после высокодозной химиотерапии (ВДХТ) и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) значительно отстает от регенерации миелоидных, NK и В-клеток [2]. При этом численное восстановление Т-клеток зачастую не сопровождается восстановлением нормального их функционирования [3], что в свою очередь чревато развитием инфекционных осложнений и рецидивом заболевания.

Ранее было показано [4], что после ВДХТ и аутологичной ТГКС (ауто-ТГСК) наблюдается длительная задержка восполнения количества CD4+ Т-лимфоцитов, а также объёма репертуара Т-лимфоцитов по специфичности. Вероятно, этот эффект связан с иммунорегуляторной способностью трансплантированных ГСК. Выявленные закономерности заставляют, в частности, обратить внимание на риск развития иммунодепрессии, связанной с использованием ГСК. Отмечено, что динамика восстановления функций иммунной системы до нормальных параметров носит длительный характер.

Существуют данные, свидетельствующие о том, что в первую очередь нормальных величин достигает содержание в крови гранулоцитов (15-30 дней), затем — дендритных клеток и NK-клеток (2-4 месяца) [5]. Уровень В-лимфоцитов восстанавливается в течение 6 месяцев, а общее количества зрелых CD3+ Т-клеток остаётся пониженным дольше и восстанавливается дифференцировано. Вначале формируется пул цитотоксических CD3+CD8+ лимфоцитов, затем — пул Т-хелперов CD3+CD4+, необходимых для формирования и размножения клонов В-лимфоцитов, от числа которых зависит широта репертуара синтезируемых антител. Восстановление численности клеток CD3+CD4+ Т-хелперов завершается только в течение второго года после трансплантации.

Пониженными остаются также показатели полноты репертуара клонов Т-лимфоцитов, различающихся между собой строением лёгкой цепи ТСН [4].

Считают, что замедление образования новых клонов Т-лимфоцитов в течение длительного времени после ауто-ТГСК, в свою очередь, защищает стволовые клетки от иммунологически активных лимфоцитов.

Предполагается, что малигнизированные В-клетки могут ускользать от иммунного надзора при злокачественных заболеваниях системы крови посредством многообразных механизмов, важную роль среди которых отводят регуляторным Т-клеткам (Treg), способным подавлять активность отдельных субпопуляций эффекторных лимфоцитов [6]. Баторов Е. В. и соавт. [7] показали, что количество CD4+FOXP3+ Т-клеток полностью восстанавливалось и значимо превышало исходную концентрацию ко дню выхода из лейкопении, а в последующем (в течение года) их относительное содержание постепенно снижалось до нормы. При этом авторами продемонстрировано, что больные с рецидивом ММ в течение первых 12 мес после ауто-ТГСК отличались значимо более высо ким относительным содержанием CD4+FOXP3+ Т-клеток на момент выхода из лейкопении. Митиной ТА. [8] дана характеристика регенерации Т-клеточной системы иммунитета в процессе VCP терапии (бортезомиб, цикло-фосфан, преднизолон) у пациентов с впервые выявленной множественной миеломой. Автором установлено исходное повышение по сравнению с группой здоровых доноров количества Т-лимфоцитов, представленных субпопуляцией CD3+CD8+CD62L-CD45RA+. Показано, что цитостатическая депрессия характеризовалась достоверным снижением количества всех исследуемых субпопуляций, с восстановлением до субнормальных нормальных значений к 30 дню межкурсового интервала.

В целом, сведения о состоянии иммунологической реактивности больных ММ в отдаленные сроки после ВХДТ и аутоТГСК носят разноречивый характер. Кроме того, отсутствует единое мнение о сроках реконституции иммунной системы, что не позволяет разработать адекватные иммунореабилитационные мероприятия.

В связи вышеизложенным целью данного исследования явилась комплексная оценка состояния клеточного звена иммунитета у больных множественной миеломой (ММ) до и после аутоТГСК.

Материал и методы. В исследование были включены 123 пациента с ММ, которым была проведена аутоТГСК в Республиканском центре трансплантации костного мозга ФГБУ РосНИ-ИГТ ФМБА России за период с 2014 г по 2019 г. Средний возраст составил 58 лет (32-64 года). Соотношение женщины /мужчины —1,27:1. Все больные получали бортезомиб-содержащую химиотерапию по схеме CVD (циклофосфан + бортезомиб + дексаметазон) или по схеме VD (бортезомиб + дексаметазон). Мобилизация ГСК периферической крови чаще проводилась вино-релбином (однократно, внутривенно струйно в дозе 35 мг/ м²) в соответствии с протоколом, утвержденным локальным этическим комитетом (№ 20 от 08.04.2015 г.), или циклофосфамидом (однократно, в дозе 3-4 г / м²) с последующим введением Г-КСФ (ленограстим или граноцит) по 10 мкг / кг / сут ежедневно, подкожно в двух равных инъекциях [9]. Режим кондиционирования перед аутоТГСК включал введение мелфалана в течение двух дней в суммарной дозе 200 мг/ м², у пациентов с тяжелой сопутствующей патологией суммарная доза мелфалана была снижена до 140 мг / м².

Забор крови и все иммунологические исследования проводили после получения письменного информированного согласия больного.

В пятицветном анализе методом многопараметрической проточной цитометрии с помощью моноклональных антител кдифференци-ровочным антигенам (CD3, CD4, CDS, CD16+56, CD25, CD19) проводилась оценка относительного содержания основных и минорных популяций лимфоцитов периферической крови до аутоТГСК (перед началом кондиционирования, п = 123), после аутоТГСК в день выхода из лейкопении (лейкоциты более 1 х Ю9/л, в среднем на 14-30-й день, п = 112), на Д+100 (п = 65), 6 мес. (п = 32) и через 12 мес. (п = 12).

Число больных, обследованных в различные контрольные сроки, варьировало в свя зи с отсутствием возможности в ряде случаев получить образцы крови либо недостаточным количеством лимфоцитов для исследования.

В качестве группы сравнения было обследовано 35 здоровых доноров крови.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0. Для оценки значимости различий между группами больных использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни для непрерывных переменных. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р < 0,05.

Результаты и обсуждение. Результаты исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у больных ММ в процессе аутоТГСК представлены в таблице.

Таблица

Динамика субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови больных множественной миеломой в процессе аутоТГСК

Популяция лимфоцитов	Обследованные группы
	доноры	До аутоТГСК	После аутоТГСКД+15	После аутоТГСК Д+100	После аутоТГСК Д+180	После аутоТГСК Д+380
CD3+(%)	61,3±0,9	65,8 ±1,8	53,4 ±4,5*	75,2 ±5,0*	60,5 ±4,5	60,4 ±1,5
CD3+CD4+(%)	36,9 ±0,9	34,9 ±1,5	24,7 ±3,7**	23,1±7,3**	21,9±4,4**	20,6 ±2,5**
CD3+CD4+CD25+ (Treg) (%)	3,2 ±0,9	1,82 ±0,2**	1,43 ±0,4**	1,41 ±0,5**	1,3 ±0,3**	0,77±0,3**
CD3+CD8+ (%)	24,8 ±0,9	27,8 ±1,9	24,5 ± 4,4	48,4 ±7,0**	34,1±4,0**	33,9 ±3,6**
CD3-CD16+ (%)	24,0 ±1,1	19,9 ± 1,6	29,5 ±4,9	13,9 ±3,5*	19,6 ±4,0	25,8 ±3,0
CD3+CD16+ (NKT) (%)	4,26 ±0,6	1,95 ±0,5**	1,85 ±0,5**	0,95 ±0,4**	5,71 ±2,0	4,26 ±0,7
CD19+ (%)	22,0 ±1,2	6,79 ±0,8**	0,7 ±0,3**	8,13±3,0**	12,2 ±3,0**	9,77 ±1,3**

— р < 0,05, достоверность различий по сравнению с контрольной группой

* — р < 0,005, достоверность различий по сравнению с контрольной группой

Оценка Т-клеточного звена иммунитета показала, что у больных ММ до проведения аутоТГСК, перед началом режима кондиционирования, показатели относительного содержания зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) и основных иммунорегуляторных популяций Т-лимфоцитов CD3+CD4+ и CD3+CD8+ были в пределах нормы и не отличались от таковых в группе контроля. Достоверные различия между группой больных и группой контроля мы получили только при сравнении содержания минорных популяций Т-лимфоцитов: наблюдалось снижение относительного содержания Treg (CD3+CD4+CD25+)

и NKT-клеток (CD3+CD16+) (р < 0,005).

В группе больных ММ после аутоТГСК на Д+15, приблизительно в день выхода из лейкопении (содержание лейкоцитов более 1 х Ю9/л), отмечалось достоверное снижение содержания зрелых Т-лимфоцитов CD3+ и Т-хелперов CD3+CD4+, по сравнению с группой контроля. Также выявлена тенденция к дальнейшему снижению количества минорных популяций Treg и NKT-клеток (р < 0,005).

Исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови на Д+100 после аутоТГСК показало восстановление содер- жания популяции зрелых Т-лимфоцитов CD3+ за счет значительного прироста количества цитотоксических Т-лимфоцитов CD3+CD8+, различия по сравнению с группой контроля были достоверными (р < 0,005). Также отмечалось снижение относительного содержания популяции Т-хелперов CD3+CD4+ и минорных популяций — Treg и NKT-клеток (р < 0,005).

На Д+180 и Д+360 после аутоТГСК у больных ММ наблюдался дисбаланс содержания основных иммунорегуляторных популяций Т-лимфоцитов: низкое содержание Т-хелперов CD3+CD4+ и значительно повышенное количество цитотоксических Т-лимфоцитов CD3+CD8+, а также низкое содержание Treg CD3+CD4+CD25+ клеток. При этом отмечался прирост NK-клеток CD3-CD16+.

Следует отметить, что у больных ММ во всех временных точках содержание CD19+ В-лимфоцитов было значительно снижено по сравнению с группой контроля.

После ВДХТ и аутоТГСК больные ММ остаются длительное время иммунокомпрометиро-ванными. Восстановление субпопуляционного состава клеток имммунной системы до нормальных величин оказывается длительным, что требует дальнейшего наблюдения и анализа.

Повышенное содержание цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток у больных ММ после аутоТГСК, может рассматриваться в качестве предиктора клинического эффекта. Отставание формирования пула Т-хелперов CD3+CD4+ может быть связано с их чувствительностью к апоптозу и возрастной инволюцией тимуса.

У большинства пациентов с ММ (85 %-90 %) на момент установки диагноза наблюдается т.н. «иммунопарез» [10]. Это состояния проявляется в виде снижения уровня поликлональных или не пораженных опухолевым процессом иммуноглобулинов. [11]. В феномене иммунопареза задействован ряд механизмов, например, нарушенная дифференцировка В-клеток, связанная с дисфункцией гуморального и клеточного иммунитета, а также снижение численности В-лимфоцитов, обусловленное цитокинами, ко торые продуцируют миеломные клетки (TGF-0). [12]. V. Gonzalez-Calleet al. [13] высказали предположение, что сохранение иммунопареза после ауто-ТГСК наряду с прочими маркерами иммунной дисфункции может служить предиктором прогрессии или снижения выживаемости у пациентов с ММ.

Низкое содержание В-лимфоцитов CD19+ свидетельствует о недостаточности гуморального звена иммунитета у пациентов всего периода наблюдения, а в сочетании с низким содержание Т-хелперов CD3+CD4+, может способствовать развитию инфекционных осложнений у больных ММ после аутоТГСК. Анализ полученных данных, с учетом сведений об инфекционных осложнениях, может способствовать установлению критических величин содержания иммунорегуляторных клеток в процессе восстановления после аутоТГСК, ниже которых необходимо проводить иммунокорригирующую терапию, например, введение внутривенных иммуноглобулинов, с целью снижения риска возникновения инфекционных осложнений и нормализации иммунного гомеостаза.

Наше исследование показало, что низкое относительное содержание минорной популяции Treg клеток на протяжении всего периода наблюдения может быть показателем эффективности аутоТГСК, тогда как развитие рецидива заболевания ассоциируется с более высоким содержанием этой популяции Т-лимфоцитов, что не противоречит данным других исследователей [7,14].

Естественные киллерные (NK) клетки и уб Т-лимфоциты, обладающие цитотоксической способностью, восстанавливаются в ранние сроки после аутоТГСК и способствуют иммуносупрессии опухоли, а также осуществляют контроль за инфекционным процессом [15; 16].

Исследование клеточного звена иммунитета в отдаленные сроки после ауто-ТГСК позволит получить данные, которые смогут более полно охарактеризовать процессы реконституции иммунной системы в посттрансплантационном периоде.