GACP талаптары бойынша Crocus alatavicus сімдігін интродукциялауды технологиялы аспектілері

Введение. Растения являются источником биологически активных веществ и широко применяются в медицине и фармации. Флора Казахстана насчитывает более 6000 видов сосудистых растений, из них 1500 видов считается лекарственными [1]. Несмотря на богатую флору страны, создание лекарственных средств растительного происхождения и доведение их до серийного производства могут привести к истощению запасов растительного сырья. Интродукция растений позволяет одновременно решить вопросы сохранения биоразнообразия в природе и разработать методы культивирования эндемичных растений в промышленном масштабе. Для обепечения качества лекарственнных растений, а также во избежание нанесения вреда окружающей среде с 2018 года в странах ЕАЭС внедрены правила стандарта GACP [2, 3]. В КазНМУ имени С.Д. Асфендиярова ведутся научноисследовательские работы по изучению лекарственных растений Казахстана с целью расширения применения растений в медицине и фармации.

Одним из этих растений является шафран алатауский (крокус алатауский, Crocus alatavicus Regel & Semenow ) из семейства Iridaceae Juss . C. alatavicus - клубнелуковичный эфемероид, эндемичный вид Тянь-Шаня. Всесторонний анализ экстракта шафрана ала-тауского выявил его антибактериальную, противогрибковую активности, заметный противовирусный эффект в отношении HHV-1, а также значительную противоопухолевую активность в отношении метастатического рака предстательной железы [4].

Нами впервые разработана технология интродукции C. alatavicus методом семенного размножения. В целях освобождения от импорта, развитие промышленного производства лекарственного растительного сырья, введение в культуру отечественных растений с использованием инновационных технологий интродукции является одним из путей создания устойчивой сырьевой базы. Культивирование – это выращивание растений в промышленных масштабах по рекомендациям агротехники возделывания в данных климатических условиях с целью получения качественного сырья. Интродукция растений является процессом, предшествующим культивированию того или иного вида растений. В настоящее время, проблема сохранения и рационального использования перспективных лекарственных растений путем культивирования остается весьма актуальной в связи с усилением антропогенного влияния на окружающую среду.

Разработка технологии интродукции C. alatavicus методом семенного размножения, а также технологии сбора и заготовки качественного сырья в соответствии правилами GACP и создания предпосылок культивирования в промышленных плантациях имеет научное и практическое значение.

Целью данного исследования является разработка технологии интродукции шафрана алатауского способом семенного размножения по принципам GACP.

В рамках исследований поставлены следующие задачи: сбор, заготовка и идентификация семян, выбор оптимального местоположения экспериментального участка, анализ почвы, подготовка экспериментальных площадок к высеву семян, подготовка посевного материала, посев семян, полив и поддержание растения, сбор и переработка сырья.

Материалы и методы исследований. Объектом исследования являются семена шафрана алатауского, собранные в период полного созревания семян (до растрескивания коробочки) в конце мая и начале июня. Технологические аспекты интродукции проводились в соответствии с требованиями GACP. В работе применяли пунктирный способ посева семян. Дозировка биогумуса и нитроаммофоса проводились в соответствии с утвержденной инструкцией по применению. Онтогенез C. alatavicus проводили по методике автора, д.б.н. Седельниковой Л. Л. [5].

Для надлежащего проведения технологии интродукции крокуса алатауского нами разработаны стандартные операционные процедуры (СОП) в соответствии алгоритму по направлениям:

Сбор, заготовка и идентификация семян. В качестве посевного материала нами использованы семена первого года. Собранные образцы семян и растение идентифицированы Институтом ботаники и фитоинтродукции РК как вид C. alatavicus из семейства Iridaceae Juss .

Выбор места культивирования. Целью является - выбор оптимального местоположения экспериментального участка для посевных площадок на опытно-производственной плантации ТОО «Фитолеум».

C. alatavicus не требователен к месту возделывания, но согласно литературным данным следует отдавать предпочтение влажным, открытым солнечным участкам [6, 7]. В связи, с чем были определены 6 участков площадью 1м 2 . Далее, в рамках исследований определили участки для осеннего посева (участок №1, участок №2 и участок №3) и для весеннего посева (участок №4, участок №5 и участок №6).

Анализ почвы. Исследование почвы проводили согласно СОП (Отбор и анализ проб). Согласно требованиям GACP, почва для выращивания лекарственных растений не должна содержать тяжелые металлы, иметь допустимые критерии качества.

Подготовка почвы и внесение удобрений. Подготовка почвы заключается в двухэтапной осенней перекопке: первая -была произведена в конце сентября для уборки сорняков, вторая - в начале ноября для улучшения структуры почвы. Одновременно с процессом перекопки в почву вносили различные удобрения в зависимости от экспериментальных площадок.

В почву на участках №1 и №4 внесли органические удобрения, на участках №2 и №5 - минеральные удобрения и участки №3 и №6 использовали в качестве контрольных без внесения удобрений. Доза, способ и сроки применения удобрений на экспериментальных участках приведены в таблице 1.

Таблица 1 – Доза, название, состав, способ и сроки применения внесенных удобрений на экспериментальных участках

№ участки	Площадь участка	Тип и доза применения препарата	Название, состав и производитель удобрения	Способ и время применения
Осенний посев семян
№1	1 м 2	Органическое, 300 г/м 2	«Вермикомпост». Биогумус содержит: гумуса 30 %, а также 0,8–3,0 % N, 0,8–5 % P, 1,2 % K и 2–5 % Са. ТОО «Стрелец», Казахстан	Внесение перед посевом семян и подкормка на третьем году в период вегетации (до цветения)
№2	1 м 2	Минеральное, 10 г/м 2	Нитроаммофос Удобрение содержит: 22% Р2О5, 22% N; ТОО «Казфосфат», Казахстан	Внесение перед посевом семян и подкормка на третьем году в период вегетации (до цветения)
№3	1 м 2	Без внесения удобрений (контрольный участок)	-	-
Весенний посев семян
№4	1 м 2	Органическое, 300 г/м 2	«Вермикомпост». Биогумус содержит: гумуса 30 %, а также 0,8–3,0 % N, 0,8–5 % P, 1,2 % K и 2–5 % Са. ТОО «Стрелец», Казахстан	Внесение перед посевом семян и подкормка на третьем году в период вегетации (до цветения)
№5	1 м 2	Минеральное, 10 г/м 2	Нитроаммофос Удобрение содержит: 22% Р2О5, 22% N; ТОО «Казфосфат», Казахстан	Внесение перед посевом семян и подкормка на третьем году в период вегетации (до цветения)
№6	1 м 2	Без внесения удобрений (контрольный участок)	-	-

Подготовка посевного материала. Определение срока высева семян является основным вопросом при семенной репродукции растений. Чтобы определить срок посадки, нам необходимо было исследовать влияние естественной стратификации на всхожесть семян. Для этого высев семян осуществили в два сезона: осенью и весной.

Посевной материал подготовили к посеву путём замачивания в растворе биости- мулятора «Эпин-экстра» (Фирма «НЭСТ-М», Россия). Раствор готовили из расчёта 4 капли на 100 мл воды и замачивали семена в течение 10 часов.

Посев семян . Использован пунктирный способ - рядовой посев с одиночным равномерным распределением семян в рядах, то есть семена располагаются в ряду по одному на заданном расстоянии друг от друга. Ширина междурядий составляла 25 см. При посеве формировали лунки глубиной 2 см и засыпали в них слой песка, примерно в 1 см. Подготовленные семена укладывали на дно лунки с расстоянием между семенами, примерно 10 см. Сверху закрывали слоем почвы высотой от 0,5 до 1 см и мульчировали скошенной сухой травой.

Полив и поддержание культуры . В ранневесенние месяцы наблюдается дождливая погода и растения дополнительных поливов не требуют. Полив, с наступлением засушливой погоды проводили с частотой от 2 до 6 раз для продления вегетационного периода по необходимости.

В первом году вегетации один из поливов проводили с раствором «Эпин-экстра» в концентрации 0,2 мл на 300 мл воды, для стимулирования корнеобразования. Прополку проводили со второго года вегетации и в последующие годы, применяя мульчирование слоем скошенной сухой травы. На третьем году вегетационного периода почву экспериментальных участков №1 и №4 обогатили сухим биогумусом, для чего вокруг растений удаляли верхний слой старой почвы примерно в 0,5-0,7 см и засыпали биогумус. Во втором варианте нашего эксперимента почву для участков №2 и №5 обогащали раствором нитроаммофоса в концентрации 2 г/л.

Обзор литературы

C. alatavicus в условиях интродукции размножается клубнелуковицами и семенами. Результаты нашего выбора не противоречат результатам проведенных интродукций С. alatavicus в Ботанических садах России, Украины и Узбекистана. По мнению авторов [8-10], в связи слабым и неэффективным вегетативным размножением целесообразным считается размножение семенами. На всхожесть семян и выживаемость сеянцев влияют многие факторы: срок хранения семян, срок посева семян, стратификация, применение биостимулятора и обогащение почвы удобрениями.

Установлено, что семена C. alatavicus не теряют способность к всхожести в течение 3-4 лет, лучшая всхожесть определена у семян, которые хранились не более года. Срок посева семян является еще одним фактором, который повлияет на всхожесть семян. Украинские исследователи [8] выбирают весенний посев семян, российские [9] и узбекские ученые [10] – осенний посев семян С. alatavicus . При осеннем посеве всхожесть семян и выживаемость сеянцев были выше.

Китайские ученые изучали факторы, влияющие на прорастание семян и развитие зародышей шафрана алатауского и утверждают, что С. alatavicus можно легко размножить из семян, подвергнув семена к естественной стратификации. Согласно классификации покоя семян разработанной Дж. М. и К. С. Башкиными (Baskin & Baskin, 2014) имеется 9 уровней морфофизиологического покоя (МФП) семян [11-13]. Результаты лабораторных экспериментов ученых показывают, что для семян С. alatavicus характерен глубокий простой эпикотильный тип МФП. Чтобы нарушить состояние покоя семян растений с данным типом МФП необходимо соблюдать последовательность температурного режима при стратификации: теплая → прохладная → холодная → прохладная. Либо, подвергая семена естественной стратификации для умеренных регионов мира, где характерны теплое лето, прохладная осень, холодная зима и прохладная весна.

Следующий фактор, который влияет на всхожесть семян и выживаемость сеянцев – биостимулятор. Нами выбран «Эпин-экстра», действующим веществом препарата - эпибрас-синолид. Соединение относится к группе брас-синолидов - гормоны, поддерживающие в норме иммунную систему растений, особенно в стрессовых ситуациях [14, 15].

Согласно литературным данным [16, 17], органические и минеральные удобрения положительно влияют на всхожесть семян и прорастания сеянцев некоторых растений. На сегодняшний день не изучено влияние удобрений на прорастание семян C. alatavicus . Имеется результаты исследований влияния органических и минеральных удобрений на биометрические показатели Crocus sativus L [18, 19].

Предварительное обогащение почвы биогумусом перед посевом и подкормка на третьем году вегетационного периода является еще одним фактором, влияющим на всхожесть семян и выживаемость сеянцев. Нами установлено, что внесение биогумуса при осеннем и весеннем посевах семян дает высокие показатели всхожести семян и выживаемости сеянцев. Результаты не противоречат литературным данным. Литературный обзор показывает, что биогумус может обеспечивать хороший иммунитет у растений, повышая их устойчи- вость к стрессовым ситуациям, сокращая сроки прорастания семян, обеспечивая высокую приживаемость сеянцев [20-22].

Результаты и их обсуждение. Разработана технология интродукции крокуса алата-уского согласно руководству GACP, принципиальная схема представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 – Принципиальная схема интродукции C. alatavicus

По результатам исследования влияния сроков посадки и внесения удобрений на всхожесть семян и выживаемость сеянцев установлено, что всхожесть семян при осеннем посеве значительно выше, чем при весеннем посеве (табл. 2).

Таблица 2 – Влияние удобрений и время посева на всхожесть семян и выживаемость сеянцев

№ участки	Вид удобрения	Количество семян, штук	Всхожесть семян, %	Выживаемость сеянцев, %
Осенний посев семян
№1	органическое	50	75	91
№2	минеральное	50	68	85
№3	без внесения удобрений (контрольный участок)	50	49	63
Весенний посев семян
№4	органическое	50	31	62
№5	минеральное	50	29	55
№6	без внесения удобрений (контрольный участок)	50	23	41

Превосходство всхожести семян и выживаемости сеянцев осеннего посева можно объяснить тем, что семена прошли естественную стратификацию. При естественной стратификации нахождение семян долгое время во влажной и прохладной среде может привести к возникновению плесени и гнили. Обработка семян перед посевом в растворе «Эпин-экстра» обеспечила ускоренное прорастание семян и защиту при некоторых стрессовых ситуациях, например, возвратных заморозках и чрезмерной влаге.

Результаты исследований показали, что при осеннем посеве и применении биогумуса всхожесть семян и выживаемость сеянцев составили 75% и 91 %, соответственно. При внесении нитроаммофоса – 68 % и 85 %, а на контрольном участке - 49 % и 63%. При весеннем посеве показатели всхожести семян и выживаемости сеянцев были значительно ниже. При применении биогумуса, всхожесть семян и выживаемость сеянцев составили 31% и 62%, соответственно, при внесении нитроаммофоса - 29% и 55%, на контрольном участке - 23 % и 41 %. Полученные результаты позволяют предположить, что соединения, входящие в состав биогумуса активно проникают в растительные ткани, тем самым запускают обменные внутриклеточные процессы, выводя семя из состояния покоя и способствуя лучшей всхожести по сравнению с контролем.

В условиях интродукции, высеянные в октябре месяце 2018 года семена, начали прорастать в марте 2019 года. Онтогенетическое изучение крокуса алатауского позволило установить, что прегенеративный период имеет четыре возрастных состояния ( se, p, j im ).

При установлении возраста руководствовались методикой д.б.н. Седельниковой Л. Л. Растение визуально рассматривали и по количеству листьев определяли возраст C. alatavicus: 1 лист - ювенильный ( j ), 2-3 листьев - имматурный ( im ), 4-5 листьев – вир-гинильный ( v ) и 6-10 листьев – генеративный возраст ( g ). Генеративный возраст делится на три возрастные категории: молодой генеративный ( g 1), среднегенеративный ( g 2) и зрелый генеративный ( g 3).

Растение в весенний сезон четвёртого года вегетации (2022 г.) перешел в генеративный период (g) и впервые главный (материнский) побег зацвел. После завершения цветения у крокуса алатауского происходило сильное отрастание листьев, и формировался плод. Семена шафрана алатауского собирали в период полного созревания семян (до растрескивания коробочки) в начале июня (рис. 2).

Рисунок 2 – Четвертый год вегетационного периода C. alatavicus (май, 2022 г.) на опытных участках для интродукции

1а и 1б генеративный период (g) онтогенеза и 1в семена C. alatavicus

Заключение,выводы. В результате проведенных исследований по интродукции Crocus. alatavicus способом семенного размножения установлено следующее:

• 1.    При семенном размножении предпочтителен осенний высев семян C. alatavicus , так как всхожесть семян составила – 49 %, выживаемость сеянцев – 63 %, а в

• 2.    Внесение органического удобрения биогумуса в дозе 300 г/м 2 перед посевом семян положительно сказывается на всхожести семян – 75 % и выживаемости сеянцев – 63 %. Применение минерального удобрения показало

• 3.    Результаты интродукции C. alatavicus в период с 2018 по 2022 гг. показали хорошую всхожесть семян и высокую выживаемость сеянцев, что позволяет рекомендовать растение для внедрения в культуру. Растение в четвёртом году вегетации перешел в генеративный период и впервые главный побег зацвел и сформировался плод.

весеннем высеве, всхожесть семян составила – 23 %, выживаемость сеянцев – 41 %

результаты ниже: всхожесть семян составила – 68 %, выживаемость сеянцев – 85 %.

Таким образом, разработанный способ технологии интродукции крокуса алатауско-го семенами позволяет размножать растение без ущерба природным популяциям с целью дальнейшего рационального использования в научно-практической медицине, сохраняя этот вид в культуре.