Идентификация термоиндуцированных модификаций белка в коровьем молоке с помощью двумерного электрофореза

Funding: the study was supported by the Federal State Budgetary Institution VNIMI as part of state assignment FNSS-2025-0001.

Введение. Молочная продукция популярна во всем мире, ее производство растет с каждым годом, несмотря на такие ограничения, как растущий спрос на растительные альтернативы и волатильность цен [1]. В 2024 г. мировое производство молока достигло 982 млн т [2], что при пересчете составляет более 10 % от общего потребляемого белка в мире [3, 4]. Мировая молочная промышленность по состоянию на 2024 г. оценивается в 999,4 млрд долларов США с прогнозируемым ростом до 1,243 трлн долларов США к 2028 г. [5]. Поскольку молоко представляет собой скоропортящуюся пищевую систему, одним из путей сохранения его качества для длительного хранения и последующего использования является удаление из него воды с помощью различных методов сушки (например распылительной, сублимационной), которые за счет ксероанабиотического эффекта предотвращают рост микроорганизмов и подавляют ферментативные реакции [6–9]. Сухое молоко широко используют для выпуска различных пищевых продуктов для достижения заданных технологических или функциональных свойств, сенсорных характеристик, пищевой ценности [7, 10]. Кроме того, сухое молоко удобно при транспортировании, оптимизации логистики и маркетинга [10, 11]. Объем мировой торговли сухим обезжиренным молоком и сухим цельным молоком в 2024 г. достиг более 2,5 млн т для каждого вида [2]. Масштабы использования сухого молока в пищевой промышленности побуждают исследователей к более глубокому изучению процессов трансформации составных частей молочной системы, происходящих при производстве сухих молочных консервов, для повышения как его качества [12], так и качества вырабатываемых с использованием сухого молока пищевых продуктов [13].

На качество и технологические свойства сухого молока в первую очередь влияют основные процессы технологического воздействия на молоко сырое при получении сухих форм (пастеризация, сгущение, сушка) [14–16] и последующая длительность и условия хранения [10, 17–19]. Пастеризация является ключевым и критически важным этапом обработки сырого молока, обеспечивающим соответствие готового продукта санитарно-гигиеническим требованиям [20]. В исследовании [21] сообщается о решающем влиянии процесса термообработки на основные структурные и функциональные изменения сухого молока. При этом выбор температурного режима и его длительности должен представлять собой компромисс между эффективностью уничтожения микроорганизмов, сохранением нативных свойств составных частей молока, в т. ч. стабильности белков, и энергосбережением процесса [11]. Согласно [22, 23], в мировой практике сухое обезжиренное молоко в зависимости от термообработки перед сгущением ранжируют по 3 классам (низкий – 70 °С/15 с; средний – 85 °С/60 с или 90–105 °С/30 с; высокий – 90 °С/5 мин или 120 °С/1–2 мин) на основе значений индекса азота сывороточного белка (не менее 6,00; от 1,51 до 5,99; не более 1,50 мг не-денатурированного сывороточного белка в 1 г сухого молока соответственно). Перечисленные температурные режимы оказывают различное влияние на основные белки молока (казеины и сывороточные), приводя в большей или меньшей степени к модификации их структуры, образованию новых соединений или придавая им определенные функциональные свойства [24, 25]. В связи с этим ученые проводят различные исследования, связанные с установлением корреляций между температурной нагрузкой на молоко и изменением белковой фракции, а также технологическими свойствами сухого молока.

Термическое воздействие на молоко приводит к глубоким молекулярным и структурным изменениям белков. α-лактальбумин, β-лактоглобулин и другие сывороточные белки частично денатурируют при температуре 60–70 °С, что сопровождается потерей свободных SH-групп и увеличением гидрофобности молекул [26]. Ученые в исследовании [26] показали, что при 95 °С нарушается вторичная структура сывороточных белков, происходит снижение содержания сульфгидрильных групп на 75,9 %, а гидрофобность повышается на 44 %. Раскрытие третичной структуры и распад внутримолекулярных связей ведут к образованию агрегатов κ-казеина, β-лак-тоглобулина и других сывороточных белков с задействованием дисульфидных связей [27]. С применением методов рамановской и инфракрасной спектроскопии [26, 28] установлено перераспределение элементов вторичной структуры белков после пастеризации: увеличение количества «рандомных» петель и β-структур при одновременном снижении количества α-спира-лей и β-поворотов. Флуориметрическими методами [29] зафиксировано снижение флуоресценции триптофана, опосредованное денатурацией белков, и нарастание флуоресценции продуктов реакции Майяра. Взаимодействие лактозы с белками молока также показано в работе [30], в которой с использованием масс-спектрометрии (MALDI-TOF, ESI) определены продукты гликирования α-лактальбумина и β-лактоглобулина: аддукты лактозилизина, Nε-(карбоксиметил)лизина и другие окисленные/гликированные фрагменты. Таким образом, тема изучения белковых изменений в молоке достаточно изучена, однако в литературе не встречается информация о полном расшифрованном пептидном профиле белковых пятен, которые выявлены с использованием метода двумерного электрофореза.

Цель исследования – изучить термоиндуцированные трансформации белков молока при различной температуре пастеризации для их дальнейшей расшифровки и оценки сохранности детектированных соединений в сухом молоке при его производстве и хранении.

Задачи : провести электрофоретическое разделение белков обезжиренного молока, подвергнутого различным режимам пастеризации; денситометрически оценить качественное и количественное изменение белковых фрагментов;

проанализировать влияние температуры на стабильность основных детектируемых белковых пятен; определить термоиндуцированные изменения белков молока при его пастеризации.

Объекты и методы. Для исследования влияния термической нагрузки на белковый профиль молока была проведена подготовка образцов путем пастеризации обезжиренного молока при разных температурах: 70, 80 и 90 °С с выдержкой в течение 30 с. В качестве контроля использовался образец термизованного молока (45 °С).

Объектом исследований являлись образцы обезжиренного молока с различной термической обработкой (табл. 1).

Таблица 1

Маркировка образца	Описание образца
Контроль	Образец обезжиренного молока без пастеризации, нагретый до 45 °С
М70	Образец пастеризованного обезжиренного молока, обработанный при 70 °С в течение 30 с
М80	Образец пастеризованного обезжиренного молока, обработанный при 80 °С в течение 30 с
М90	Образец пастеризованного обезжиренного молока, обработанный при 90 °С в течение 30 с

Маркировка исследуемых образцов обезжиренного молока

Labeling of the studied samples of skim milk

Выработку образцов частично проводили с использованием оборудования ЦКП «ВНИМИ». Пастеризацию образцов проводили с применением лабораторной установки, разработанной коллективом авторов ФГАНУ «ВНИМИ».

Для оценки влияния тепловой нагрузки на белковый профиль молока при различных условиях обработки использован двумерный электрофорез в полиакриламидном геле и компьютерная денситометрия.

Двумерный электрофорез с изоэлектрофокусированием в амфолиновом буфере (IEF-PAGE, равновесный вариант) выполняли, как описано ранее [31]. Детекцию белков на двумерных электрофореграммах проводили последовательным окрашиванием кумасси голубым R-250 (СВВ R-250) и азотнокислым серебром. Молекулярные массы (ММ) белковых фракций определяли с использованием набора высокоочи-щенных рекомбинантных белков с молекулярными массами 10–200 кДа «PageRuler™ Unstained Protein Ladder» (#SM0661 – 14 белков) фирмы «Fermentas» (США).

Для оценки общего количества детектируемых белков использовали цифровые изображе- ния электрофореграммы и/или изображения отдельных фрагментов, полученные с помощью сканирования на Epson Expression 1680 [32]. Сканирование выполняли в следующем режиме: разрешение 300 dpi, 48 bit Color. Полученные цифровые изображения редактировали в графическом редакторе и обсчитывали количественное содержание белков с помощью пакета программ ImageMaster 2D Platinum версий 7 («GE Healthcare», Швейцария). При определении количества белка использовалось не менее 3 электрофореграмм с равным нанесением. Разброс значений оптической плотности составлял не более ± 1,5 %.

Исследования экспериментальных образцов проводили в ЦПК «Промышленные биотехнологии» ФИЦ Биотехнологии РАН.

Результаты и их обсуждение. В результате электрофоретического разделения белковых фракций контрольного образца без температурного воздействия (рис. 1, А ) детектировано 26 белковых пятен в диапазоне молекулярных масс от 10 до 70 кДа и диапазоне значений изоэлектрической точки (pI) от 4,80 до 9,20.

Рис. 1. Двумерная электрофореграмма исследуемых образцов. Стандарты молекулярных масс представлены справа, значения pI отмечены снизу: А – контроль; Б – М70; В – М80; Г – М90 A two-dimensional electropherogram of samples under study. Molecular mass standards are shown on the right, and pI values are shown at the bottom. A – Control; Б – M70; В – M80; Г – M90

Из электрофореграмм образцов, подвергнутых воздействию различных режимов тепловой обработки, видно, что при переходе к более высоким температурам нагрева количество белковых фракций значительно снижается. При этом следует обратить внимание на низкую интенсивность окраски геля с образцом М80 краской кумасси (рис. 1, В ) в сравнении с образцами, пастеризованными при 70 и 90 °С (рис. 1, Б, Г ). По результатам анализа электрофореграмм выявлено уменьшение пятна № 1 вплоть до полного исчезновения при 90 °С. Пятно № 4

перестает детектироваться после нагревания при 70 °С. Пятна № 15, 16, 27 и 28 равномерно снижались в количественном выражении и перестали детектироваться при пастеризации при 90 °С. Белковые отметки под номерами 12 и 13 исчезли при температурной обработке. Интерес представляет появление двух специфичных пятен – № 30 и № 31 (рис. 1, Г ) – при параметрах пастеризации 90 °С. Дополнительно проведен денситометрический анализ снижения интенсивности белковых пятен, представленный в таблице 2.

Таблица 2

Денситометрическое сравнение интенсивности пятен при термообработке относительно контроля

Densitometric comparison of spot intensity during heat treatment relative to control

Номер белкового пятна	Количественные изменения
	70 °С	80 °С	90 °С
1	50 %	50 %	н. д.*
4	н.д.	н. д.	н. д.
15	75 %	60 %	н. д.
16, 27, 28	50 %	40 %	н. д.
30	н. д.	н. д.	Появилось
31	н. д.	н. д.	Появилось

Примечание: * – не детектировано.

Еще одной особенностью исследуемых образцов являлся длинный трек белкового материала по всей протяженности геля на электрофореграммах с образованием дискретных форм пятен белков. Подводя итог, можно отметить, что эффект термообработки молока сохраняет часть белков, но существенно снижает их количество с образованием ряда промежуточных фрагментов. Результаты требуют дальнейшей расшифровки пептидного профиля белковых пятен для лучшего понимания трансформации белковых компонентов молочной матрицы.

Полученные в ходе исследования электрофореграммы подвергли обобщенному анализу с помощью компьютерной денситометрии, который показал, что термообработка приводит к снижению общего количества детектируемых белков на 77 % (рис. 2).

Рис. 2. Результаты оценки снижения интенсивности белковых пятен Results of the evaluation of the reduction in the intensity of protein spots

Наиболее интенсивные пятна, зафиксированные при электрофоретическом разделении контрольного образца в области 25–35 кДа при значениях pI 4,80–5,50 и в области 20–10 кДа, предположительно соответствуют казеиновым фракциям и сывороточным белкам соответственно [33]. Полученная картина характерна для типичного профиля молока и соотносится с результатами работы [34], в которой авторы выявили преобладание пятен в диапазоне 14–67 кДа и pI 4,60–8,80, соответствующих казеиновым фракциям и основному набору сывороточных белков (бычий сывороточный альбумин, α-лак-тальбумин и β-лактоглобулин). Множественные слабоокрашенные пятна в зоне молекулярных масс 15–25 кДа могут быть характерны для продуктов микрогетерогенности, а разные значения pI – для продуктов фосфорилирования или частичной деградации белковых компонентов молочной системы. Перечисленные эффекты модификации нативной белковой матрицы молока сопоставимы с содержанием исследований [33–35], в которых авторы отмечают влияние температуры на возникновение в системе агрегатов и изменения структуры белков молока. Показанная низкая интенсивность окраски геля с образцом М80 может быть связана с тем, что при нагревании молока до температу- ры 70–80 °С β-лактоглобулин частично разворачивается и образует с κ-казеином агрегаты [26], устойчивые к SDS [36]. В исследовании [26] установлено, что при 75–95 °С значительно снижается содержание свободных сульфгидрильных групп (до 24 % относительно контроля) и повышается гидрофобность поверхности белковых молекул. В этой связи в гель «проходит» меньше белковых веществ и электрофореграмма плохо окрашивается. Обработка молочной системы при температуре 90 °С способствует формированию менее ковалентных и более гидрофобных агрегатов белковых молекул, которые разрушаются SDS и β-меркаптоэтанолом [36]. Этим также обосновывается более интенсивное окрашивание электрофореграммы образца, пастеризованного при 90 °С (рис. 1, Г), в сравнении с молоком, нагретым до 70 °С (рис. 1, Б).

По результатам анализа электрофореграмм выявлено уменьшение пятна № 1, предположительно относящегося к бычьему сывороточному альбумину (молекулярная масса около 69 кДа) [37]. Эффект снижения доли белка, вплоть до полного исчезновения при 90 °С, может быть ассоциирован с его термолабильностью и потерей нативной структуры при нагревании до температур выше 65 °С [38]. Пятна № 4, 12 и 13, исчезающие при нагревании молока выше 70 °С, располагаются в области молекулярных масс фракций казеина. Согласно данным литературы, исчезновение пятен, принадлежащих казеинам, может объясняться образованием комплексов между мицеллами казеина и фракциями сывороточных белков [39]. Также при нагревании возможна перестройка дисульфидных связей между κ-казеином и β-лактоглобулином и другими сывороточными белками [22]. Еще одним эффектом, протекающим при нагревании, является дефосфорилирование. Все казеины фосфорилированы в различной степени, однако отщепление фосфатной группы может дестабилизировать структуру мицелл и приводить к осаждению [40]. Интерес представляет появление двух специфичных пятен – № 30 и № 31 – при параметрах пастеризации 90 °С. Данный эффект также наблюдали авторы в работе [39], объясняя это тем, что при интенсивном нагревании до температур выше 85 °С белки молока претерпевают необратимые изменения, это выражается в появлении новых белковых пятен.

Значительное снижение белковых компонентов, детектированное с использованием денси-тометрического анализа электрофореграмм исследуемых образцов, может быть обосновано тем, что термолабильные белки при нагревании до температур, превышающих 65°С [26], могут денатурировать или распадаться на более мелкие фрагменты и терять растворимость. Продукты биохимической трансформации в последующем не детектируются при электрофоретическом разделении [39, 41]. Аналогичные тенденции описаны в работе [42], где снижение количества растворимых белков и изменение их профиля в молоке были количественно связаны с температурной обработкой.

Проанализировав полученные результаты и сопоставив их с данными литературы, можно выделить ряд ключевых изменений неферментативной природы, происходящих с белками молока при пастеризации и изменяющих распределение фракций на двумерной электрофореграмме. Под действием температуры с белками молока могут происходить не только конформационные изменения белковой глобулы, но и химические модификации аминокислот, что приводит к смещению изоэлектрических точек. С диаминомонокарбоновыми кислотами аспарагином и глутамином при нагревании может происходить неферментативное деамидирование и образование аспарагиновой и глутаминовой кислот соответственно. Таким образом, вместо незаряженного аминокислотного остатка появляется отрицательно заряженный карбоксилат, что приводит к снижению изоэлектрической точки [40]. J.W. Holland et al. показали [43], что на двумерных электрофореграммах молока появляются пятна α-S1-казеина, смещенные в кислотную область, вследствие деамидирования ряда аминокислотных остатков, входящих в состав белка в результате длительного хранения. Изменение подвижности белковых фракций также может объясняться термическим удалением посттрансляционных модификаций у белковых молекул. Например, известно, что казеины обладают различным количеством присоединенных к остаткам серина фосфатных групп. Для каждой фракции казеинов число фосфатных групп отличается: 8 для αS1-казеина, 10–13 для αS2-казеина, 5 для β-казеина и 1 для κ-казеина [44]. При этом потеря каждого из фосфорных остатков смещает изоэлектрическую точку в основную область и соответственно меняет распределение пятен на двумерном электрофорезе [45]. Также фосфатные группы влияют на способность белка связываться с додецилсульфатом натрия, их потеря снижает это свойство, следовательно, снижается и подвижность белка в полиакриламидном геле, и белковое пятно фиксируется в области больших молекулярных масс. Лактозилирование белков является так же, как и вышеописанные, неферментативным процессом, протекающим при нагревании молока. Данное биохимическое превращение является начальной стадией реакции Майяра и характеризуется связыванием лактозы и ɛ-аминогруппами лизина [46]. Таким образом, процесс лактозилирования белков под воздействием температуры может способствовать изменению результирующей картины на двумерном электрофорезе, поскольку каждая молекула лактозы добавляет к молекулярной массе аминокислотной последовательности белка 324 Да. В работе [47] авторы отмечают, что для белков с невысокой молекулярной массой, таких как α-лактальбумин (14 кДа) и β-лактогло-булин (18 кДа), процесс реагирования с лактозой приводит к образованию новых фракций при анализе трансформаций с использованием метода электрофоретического разделения. При этом каждый последующий присоединенный остаток лактозы формирует в геле новое пятно, в результате чего наблюдается вертикальная полоска пятен [46]. Также стоит отметить, что молекулярные массы фракций казеина отличаются от представленных в научной литературе в большую сторону. Причиной такого поведения белков в геле может быть их аминокислотный состав. Фракции казеина содержат большое количество остатков пролина [48], который вызывает излом вторичной структуры белка и препятствует компактной «упаковке» белковых молекул. Кроме того, отсутствие дисульфидных связей в казеинах приводит к слабому взаимодействию с додецилсульфатом натрия, что также не способствует приобретению молекулой полностью вытянутой структуры, снижая подвижность белков в геле.

Заключение. В ходе исследований установлено, что термообработка обезжиренного моло- ка при 70–90 °С приводит к значительному снижению количества растворимых белков и, как следствие, уменьшению интенсивности пятен при детектировании изменений белковых компонентов с использованием метода двумерного электрофореза. Наиболее термолабильными оказались зоны, предположительно принадлежащие бычьему сывороточному альбумину и фракциям казеина, исчезающие при температурах выше 70 °С. Для образцов, пастеризованных при 90 °С, отмечено появление новых фрагментов, которые могут быть ассоциированы с деградационными трансформациями белковой матрицы молока: вторичные структурные перестройки и/или возникновение более коротких аминокислотных последовательностей. Кроме того, изменение поведения белковых молекул в полиакрилмидном геле может быть также ассоциировано с реакциями дефосфорилирования, деамидирования и лактозилирования, ведущими к изменению электрофоретической подвижности белков. Установлено, что суммарное количество детектируемых белков снизилось на 77 % относительно контрольного терми-зованного образца, что может быть связано с денатурацией и агрегацией отдельных белков, например κ-казеина и β-лактоглобулина. Полученные результаты указывают на необходимость проведения дальнейших исследований по идентификации пептидного профиля белковых пятен методами масс-спектрометрии для расшифровки механизмов термоиндуцированных модификаций белков молока, что является целью наших дальнейших исследований. Совокупные данные о трансформации белкового профиля молока позволят в перспективе отследить его сохранность в готовом сухом молоке и в процессе его хранения для создания инструментов прогнозирования остаточного срока годности и определения возможных направлений использования продукта.