Иммуноферментная тест-система для межоперационного контроля специфичности рекомбинантного капсидного белка цирковируса свиней 2-го типа

В этих условиях вакцинация является ключевым инструментом контроля и профилактики ЦВС-2. Наряду с традиционными инактивированными вакцинами все большее значение приобретает разработка современных генно-инженерных вакцин. Такие препараты, основой которых являются рекомбинантные аналоги мажорного капсидного белка ЦВС-2 (Cap), кодируемого геном ORF-2 и содержащего основные протективные эпитопы, обладают рядом преимуществ: высокой степенью очистки, безопасностью (отсутствием риска реверсии вирулентности), стабильностью и возможностью крупномасштабного стандартизированного производства [6, 7, 8].

Производство рекомбинантных вакцин является многостадийным технологическим процессом, требующим строгого контроля сырья на каждом этапе. Одним из важнейших аспектов считается подтверждение специфичности рекомбинантного антигена – это является гарантией того, что в ходе культивирования штамма-продуцента либо стабильно экспрессирующей клеточной линии был получен целевой белок, сохранивший свою антигенную структуру [9, 10]. Особенно актуальной эта задача становится при использовании различных систем экспрессии для разных целей

(диагностических и профилактических), таких как прокариотических (E. coli) или основанных на применении перевиваемых линий клеток млекопитающих. Белки, полученные путем биосинтеза в разных системах экспрессии, могут отличаться посттрансляционными модификациями и конформацией, что потенциально влияет на их антигенные и иммуногенные свойства [11]. Следовательно, необходим универсальный метод межоперационного контроля, способный подтвердить наличие и специфичность рекомбинантного капсидного белка ЦВС-2.

Для решения этой задачи наиболее подходящим инструментом является иммуно-ферментный анализ (ИФА) в «сэндвич»-формате [12]. В отличие от таких методов, как электрофорез в полиакриламидном геле и вестерн-блоттинг, которые в первую очередь оценивают молекулярную массу белка и его реактивность к антителам в денатурирующих условиях, антигенный ИФА позволяет оценить нативную или близкую к нативной конформацию антигена. «Сэндвич»-ИФА, использующий два типа специфических антител (первичные – связывающие и вторичные – детектирующие), обеспечивает высокие чувствительность и специфичность реакции [13]. Этот метод позволяет не только подтвердить наличие рекомбинантного антигена, но и количественно оценить его концентрацию в неочищенных культуральных жидкостях и первичных клеточных лизатах, промежуточных фракциях и конечном продукте. Высокая производительность, возможность автоматизации и относительно низкая стоимость делают ИФА оптимальным выбором для рутинного межоперационного контроля в условиях промышленного производства вакцин.

Целью настоящей работы явилась разработка и валидация иммуноферментной тест-системы для межоперационного контроля специфичности рекомбинантного капсидного белка (rCap) ЦВС-2.

Условия, материалы и методы. Исследования проводились в лаборатории вирусных антропозоонозов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в период с августа по октябрь 2025 г.

Продуценты и референтные образцы антигенов .

В работе использовались:

• –    Штамм E. coli – продуцент rCap BL21 (DE3)pLysS-ORF2 (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»);

• –    Стабильно экспрессирующая клеточная линия яичников китайского хомячка - CHO-K1/PCV-ORF2 (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»);

• -    Нативный антиген ЦВС-2 (штамм «PCV2 -SHBC», ФКП «Щелковский биокомбинат» с исходной концентрацией 2 мг/мл [14];

• –    Рекомбинантный аналог Cap прокариотического происхождения (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» с исходной концентрацией 6 мг/мл [15];

• –    Рекомбинантный аналог Cap,

полученный путем биосинтеза в клеточной линии CHO-K1 (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») с исходной концентрацией 4 мг/мл.

Получение специфического пероксидазного конъюгата . Выделение специфических иммуноглобулинов из пула сывороток свиней, иммунных к ЦВС-2, производили методом трехкратного переосаждения насыщенным раствором сульфата аммония (НСА) с последующей хроматографической очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе.

Постановка ИФА . Протокол постановки непрямого варианта ИФА был оптимизирован методом шахматного титрования сенсибилизирующего иммуноглобулина, антигена и специфического пероксидазного конъюгата. 96-луночные полистироловые планшеты средней сорбции (ВНИИ «Медполимер», Россия) сенсибилизировали двукратными разведениями иммуноглобулина (от 10 до 0,05 мкг/мл) на 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6) в объеме 100 мкл/лунку и инкубировали 18 ч при 4°С. Промывку осуществляли трехкратно после каждого этапа ИФА фосфатносолевым буфером с добавлением 0,05% Tween-20 (ФСБ-Т). Нативные и рекомбинантные референс-антигены вносили в концентрациях от 1 до 0,001 мг/мл на ФСБ-Т и инкубировали 1 ч при 37°С. Специфический пероксидазный конъюгат, предварительно полученный перйодатным методом по Nakane [16], вносили в концентрациях от 5 до 0,01 мкг/мл и инкубировали аналогично. После финальной промывки добавляли по 100 мкл/лунку субстратного раствора тетраметилбензидина (ТМБ, «BD Biosciences», США), реакцию останавливали через 15 мин внесением 100 мкл 2 М H 2 SO 4 . Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре «Model 680» («Bio-Rad», США) при длине волны 450 нм. Ключевым критерием оценки сохранности специфической антигенной активности рекомбинантных аналогов белка Cap считали коэффициент специфического связывания (S/N, signal-to-noise), который рассчитывался для каждой концентрации специфических компонентов как отношение ОП ср в лунках с положительными контрольными антигенами к ОП ср в лунках с отрицательными контрольными антигенами.

Статистический анализ . Эксперименты проводились в трипликатах, данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±SD). Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения «GraphPad Prism 9.0» («GraphPad Software», США). Для построения кривых титрования использовали нелинейную регрессию. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение. Для создания стандартизированной ИФА-тест-системы, предназначенной для межоперационного контроля специфичности rCap, требовались получение и характеристика ключевых компонентов для анализа.

В качестве основного реагента для сенсибилизации твердой фазы был использован иммуноглобулин класса G (IgG), выделенный из пула сывороток позитивных к ЦВС-2

свиней. Контроль чистоты препарата, подвергнутого ионо-обменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, осуществляли при нативного     электрофореза помощи (рис. 1).

а)

б)

Рисунок 1 - Результаты хроматографической очистки анти-ЦВС иммуноглобулинов: а - гистограмма элюции IgG, б - нативная электрофореграмма очищенных IgG, где 1-3 - фракции IgG, М - маркер молекулярных масс «PageRuler» («Thermo Scientific», США)

Из электрофореграммы (рис. 1б) визуализируются две основные полипептидные фракции, соответствующие тяжелой (H-цепь, 50 кДа) и легкой (L-цепь, 25 кДа) цепям IgG, при этом выраженность минорных полос незначительна, что свидетельствует о высокой степени очистки препарата и его пригодности для дальнейшего использования в ИФА.

Далее для детекции комплекса «антиген-антитело» был получен конъюгат анти-ЦВС иммуноглобулина с пероксидазой хрена (ПХ). Конъюгация была проведена перйодатным методом, обеспечивающим ковалентное связывание через альдегидные группы, образующие при окислении углеводных компонентов молекулы ПХ. Ключевой характеристикой, определяющей чувствительность и специфичность конъюгата, является плотность мечения – молярное соотношение молекул ПХ к молекулам IgG, вычисляемое по максимумам поглощения гема пероксидазы (403 нм) и ароматических аминокислот белка (280 нм). Проведенные расчеты показали, что для полученного конъюгата плотность мечения составила 1,5:1. Такое значение способно обеспечить достаточную ферментативную активность для надежной детекции сигнала, но при этом минимизирует риск стерических погрешностей и неспецифического связывания. Конъюгат был стабилизирован добавлением 1% БСА.

На основе кривых титрования, полученных для исходной партии анти-ЦВС иммуноглобулина, была определена его оптимальная рабочая концентрация (ОРК). За ОРК принимали наименьшие концентрации специфического иммуноглобулина и пероксидазного конъюгата, которые обеспечивали: а) соотношение ОПср(К+) в диапазоне 1,1-1,4, что соответствует линейному участку детекции спектрофотометра; б) максимально возможное значение коэффициента S/N, но не менее 6,5. В данном эксперименте ОРК иммуноглобулина составила 4,5 мкг/мл, ОРК пероксидазного конъюгата - 8 мкг/мл: при этих концентрациях значение S/N составляло в среднем (10,2±0,8) ед.

Для межоперационного контроля рекомбинантных антигенов каждая новая партия rCap тестировалась с помощью разработанного ИФА параллельно с референс-образцами. Партия считалась соответствующей требованиям специфической антигенной активностью, если при ее тестировании с ОРК специфического иммуноглобулина выполнялись следующие условия:

• 1.    Значение ОП ср образца находилось в пределах ± 20% от значения ОП ср (К+), полученного для референс-антигенов в том же эксперименте.

• 2.    Значение коэффициента S/N было не ниже 85% от значения S/N референсантигенов, т.е. не ниже 8,6 ед. (для данной партии конъюгата).

Этот подход позволил стандартизировать оценку функциональной активности антигена, нивелируя межпланшетную и межоператорскую вариабельность, и гарантировать стабильность диагностических характеристик тест-системы при использовании различных серий рекомбинантных белков.

Ключевой задачей при производстве вакцин и диагностикумов с использованием технологий рекомбинантных ДНК является обеспечение стабильности и функциональной активности антигена на всех этапах - от индукции экспрессии до очистки конечного продукта. Рекомбинантный капсидный белок ЦВС-2 может быть получен в нескольких системах, каждая из которых имеет свои особенности, влияющие на фолдинг, посттрансляционные модификации и, как следствие, антигенную активность и иммуногенность белка. Исходя из этого, необходимо учитывать следующее:

• а)    Прокариотический синтез (в E. coli ) позволяет получить большое количество белка, но это часто приводит к образованию нерастворимых агрегатов (телец включения). Процесс рефолдинга (восстановления нативной структуры) является критическим этапом и напрямую определяет долю функционально активного белка в конечном препарате. Некорректно свернутые молекулы, присутствуя в образце, могут не распознаваться специфическими антителами.

• б)    Эукариотический синтез (в клетках млекопитающих) обеспечивает нативный фолдинг и гликозилирование белка, что приближает его структуру к оригинальной. Однако культуральная среда и продукты лизиса клеток могут содержать компоненты, интерферирующие в анализе и снижающие стабильность антигена при хранении.

Для унификации контроля качества было необходимо установить зависимость между концентрацией рекомбинантного белка и его функциональной активностью, выраженной посредством коэффициента S/N. Для апробации данного критерия был проведен анализ различных образцов рекомбинантного сырья: исходных клеточных лизатов, промежуточных продуктов очистки, очищенных продуктов. Все образцы перед анализом были нормализованы по общей концентрации белка до 1 мг/мл. Результаты ИФА представлены в таблице.

Таблица - Оценка специфической антигенной активности продуктов рекомбинантного синтеза капсидного белка ЦВС-2

№ п/п	Вид технологического сырья	Значение S/N	Соответствие критерию (S/N > 8,6 для данной партии конъюгата)
1	Нативный цельновирионный антиген ЦВС-2	10,3 ± 0,7	соответствует
2	Референс-антиген rCap прокариотического происхождения	11,2 ± 0,8	соответствует
3	Референс-антиген rCap эукариотического происхождения	15,2 ± 1,1	соответствует
4	Лизат клеток штамма-продуцента E. coli BL21(DE3)/pLysS-pET-28a(+)-ORF2	9,7 ± 0,4	соответствует
5	Бесклеточный экстракт штамма-продуцента E. coli BL21(DE3)/ pLysS-pET-28a(+)-ORF2	3,1 ± 0,2	не соответствует
6	Солюбилизированные тельца включения, содержащие агрегированный rCap	9,1 ± 0,7	соответствует
7	rCap прокариотического происхождения после рефолдинга и финишной очистки	10,9 ± 0,9	соответствует
8	Лизат клеток экспрессирующей линии CHO-K1/ORF2	9,5 ± 1,1	соответствует
9	Бесклеточный экстракт экспрессирующей линии CHO-K1/ORF2	8,9 ± 0,4	соответствует
10	rCap эукариотического происхождения после финишной очистки	17,7 ± 2,1	соответствует

Представленные данные демонстрируют, что партии сырья, прошедшие полный цикл очистки (позиции 7 и 10) демонстрируют высокие коэффициенты S/N, сопоставимые с референс-образцами или превосходящие их. В то же время прокариотический препарат, не подвергавшийся процедуре рефолдинга (6), и эукариотический препарат до очистки от балластных компонентов (9), демонстрировали в среднем более низкие значения S/N, несмотря на то, что общая концентрация белка была стандартизирована. Это наглядно демонстрирует преимущество разработанного метода для выявления именно функционально активного антигена. Примечательно, что варианты капсидного белка, синтезированного в эукариотической системе экспрессии (3, 10), отличались наибольшим коэффициентом S/N, что может свидетельствовать о более подходящей для серологических реакций конформации иммуногенных эпитопов.

Выводы. В рамках настоящего исследования была проведена апробация непрямой ИФА-тест-системы для полуколичественной оценки специфической антигенной активности рекомбинантного капсидного белка (rCap) ЦВС-2. Данная методика является важным инструментом для стандартизации и контроля качества биомассы, полученной при помощи технологий рекомбинантного синтеза, где стабильность функциональных свойств антигенов от партии к партии имеет критическое значение.

Ключевым результатом работы стало создание набора реагентов, в том числе рекомбинантных референс-антигенов, высокоочи-щенного IgG к ЦВС-2 и специфического пероксидазного конъюгата с плотностью мечения 1,5:1, что обеспечило высокую чувствительность и специфичность анализа. Метод продемонстрировал хорошую воспроизводимость (коэффициент вариации составил < 7%), что позволит применять его в целях рутинного межоперационного контроля. Преимуществом разработанного подхода является его универсальность: метод основан на оценке способности антигена связываться с поликлональными антителами, что позволяет эффективно детектировать и оценивать активность rCap независимо от системы его экспрессии. Метод является эффективным как в отношении белка, полученного в прокариотической системе экспрессии, так и в отношении его гликозилированных вариантов, полученных в клетках млекопитающих.

Таким образом, внедрение данного метода в производственный процесс, в том числе при использовании разных платформ синтеза антигенов либо при переходе с одной технологии на другую, позволит повысить качество конечного продукта и обеспечить их стабильность.