Иммунологический статус коров при лечении субклинического мастита альвесолом

Введение. Обеспечение населения продукцией молочного скотоводства отечественного производства (импортозамещение) является одной из важнейших задач агропромышленного комплекса [3, 7, 9]. Значительное повышение молочной продуктивности животных вызывает у них напряжение в работе всех органов и систем организма [11]. Это приводит к понижению сопротивляемости организма к неблагоприятным условиям внешней среды, увеличению частоты встречаемости маститов, а значит и к снижению молочной продуктивности [1, 4]. По мнению ученых и практиков в последнее время наиболее актуален вопрос «экологически безопасной ветеринарии», основанной на лечении животных с применением малотоксичных соединений, обладающих противомикробным, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием на ранних стадиях заболевания [2, 12]. Бессистемное применение антибиотиков, повышение устойчивости патогенных и условно патогенных возбудителей к широкому кругу противомикробных средств, используемых в ветеринарии, нарушение нормального соотношения анаэробных и аэробных бактерий в желудочно-кишечном тракте животных в результате неблагоприятных воздействий окружающей среды, стрессы, обусловленные интенсификацией животноводства, механизацией трудоемких процессов, ведут к снижению активности иммунной системы, к так называемой иммунодепрессии [6, 8, 10]. Большой научный и практический интерес представляет определение иммунологического статуса коров при лечении субклинического мастита малотоксичными гомеопатическими препаратами [13, 14, 15].

Цель исследований – изучить динамику показателей клеточного и гуморального иммунитета у коров при применении препарата «Альвесол» в лечении субклинического мастита.

Материалы и методы исследований. Научно-исследовательская работа была проведена на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы, хирургии, акушерства и внутренних болезней животных факультета ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВО РГАТУ, в научно-исследовательской лаборатории нанотехнологий в животноводстве и растениеводстве ФГБОУ ВО РГАТУ, ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России «Научно-клинический центр гематологии, онкологии и иммунологии» г. Рязани. Объектом исследований являлись коровы голштинизированной черно-пестрой породы, принадлежащие ООО «Агрокапитал» Рязанского района Рязанской области.

Диагноз субклинического мастита ставили при помощи диагностикума «Ке-нотест». Для подтверждения этого диагноза была использована методика определения соматических клеток в молоке на приборе «Соматос-мини» (ГОСТ Р 234532014). Мастит считали субклиническим при отсутствии клинических признаков и количестве соматических клеток в молоке свыше 400 тыс/см3. Объектом исследований были коровы с продуктивноcтью 5000-7500 тыс. литров за 305 дней лак- тации. Для изучения влияния препарата «Альвесол» на иммунологический статус были созданы опытная и контрольная группы коров. Животные были подобраны по методу групп-аналогов (n=8): по возрасту (4-5 лет), периоду лактации (3-4 месяц лактации), живой массе (500-550 кг), по условиям кормления и содержания, по клиническим признакам здоровья (субклинический мастит). В опытной группе для лечения субклинического мастита был назначен гомеопатический препарат в виде инъекций «Альвесол» (в 1000 мл содержатся: Alliumsativum Ø – 0,3 мл, Lachesismutus D4 – 0,1 мл, Plantagomajor Ø – 0,2 мл, Salviaofficinalis Ø – 0,3 мл и вспомогательные вещества: метил парагидроксибензоат, натрия хлорид, натрия ацетата тригидрат, кислота соляная, спирт этиловый 95 %, полисорбат 80, вода для инъекций до 1000 мл) [16]. Терапия осуществлялась по следующей схеме: внутримышечно в среднюю треть шеи по 5 мл два раза в день в течение 5 дней. В контрольной группе лечение не проводилось.

В процессе исследования иммунологического статуса отбор крови проводили рано утром до кормления по общепринятой в ветеринарии методике из хвостовой вены двукратно: в день постановки диагноза (начала лечения) и на 6 день наблюдения за животными (период выздоровления). В качестве антикоагулянта использовался К2ЭДТА. После взятия крови пробирку с образцом медленно переворачивали 8-10 раз для перемешивания крови с антикоагулянтом. Хранение и транспортировка проб осуществлялись при температуре 18–23°С в вертикальном положении в пределах 24 часов с момента взятия. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводилось c использованием моноклональных антител (IO Test, Beckman Coulter, USA) к поверхностным дифференцировочным антигенам на клетках иммунной системы методом проточной лазерной цитофлуорометрии на проточном цитофлуориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, USA). Определение концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов A, M, G проводилось методом ИФА. Функционально-метаболическую активность нейтрофилов оценивали по результатам реакции восстановления нитросинеготетразолия в НСТ-позитивных нейтрофилах.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием критерия Стьюдента. Результаты исследований обрабатывались на IBM PC с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel.

Результаты исследований. Согласно ранее проведенным нашим исследованиям, на основании изучения статистических данных ветеринарно-зоотехнической документации в ООО «Агрокапитал» за 2018 г, мы установили, что средняя молочная продуктивность коров в этом опытном хозяйстве была в пределах средних значений по РФ и составляла 6934 тыс. кг молока.

Исходя из данных таблицы 1 , стоит отметить, что частота встречаемости клинического и субклинического мастита в зимне-весенний период 2018 года у коров в ООО «Агрокапитал» составляла 13,2 и 32,9 % соответственно.

Таблица 1 ‒ Показатели молочного производства ООО «Агрокапитал»

№ Показатели

1	Поголовье, гол	808
2	Дойное стадо, гол	295
3	Средняя продуктивность, тыс. литров за 305 дней лактации	6934
4	Частота встречаемости клинического мастита, %	13,2
5	Частота встречаемости субклинического мастита, %	32,9

Эти данные говорят о завышенной доле субклинического мастита среди незаразной патологии, что создает повышенный риск развития клинической формы воспаления вымени. В предыдущих научно-исследовательских работах было проведено бактериологическое исследование проб молока от коров с субклиническим маститом и был обнаружен Staphylococcus аureus в 85,6 % случаев. Предварительно была определена терапевтическая эффективность альвесола в лечении субклинического мастита [2]. Для более тщательного изучения влияния гомеопатического препарата на организм коров при лечении субклинического мастита, было принято решение выяснить его влияние на иммунологический статус.

В ходе научных исследований мы проследили влияние альвесола на показатели клеточного и гуморального иммунитета коров с субклиническим маститом ( таблица 2 ).

Таблица 2 ‒ Изменение лейкоцитарного профиля у коров с субклиническим маститом до и после лечения

Показатели	Группы
	до лечения	контроль (n=8)	после лечения	контроль (n = 8)
	опыт (n = 8)		опыт (n=8)
Лейкоциты, 109 г/л	11,3±0,61	11,8±0,85	8,15±0,98*	14,6±0,82*
Нейтрофилы, 109 г/л	6,78±0,56	6,42±0,48	3,92±0,65* ∗	8,73±0,78
Нейтрофилы, %	60,0±2,42	54,0±1,95	48,1±1,46* ∗	59,8±1,38*
Ю, %	-	-	-	-
П, %	14,0±2,24	10,3±1,56	4,1±0,96**	17,8±1,15**
С, %	46,0±2,18	43,7±2,15	44,2±2,04	42,0±1,96
Эозинофилы, %	3,8±0,29	8,2±0,65	3,6±0,45	4,4±0,32
Базофилы, %	0,7±0,06	0,8±0,12	0,6±0,09	0,8±0,09
Моноциты, %	4,8±0,56	8,6±0,95	6,7±0,34	7,0±0,86
Лимфоциты,109 г/л	3,47±0,98	3,36±0,85	3,34±1,12	3,28±0,95
Лимфоциты, %	30,7±3,18	28,4±3,12	41,0±3,22*	28,1±2,74

*- р<0,05, ** - р<0,01 – разница достоверна по сравнению с показателями до лечения.

При оценке лейкоцитарной формулы крови коров с субклиническим маститом, отобранных до лечения, во всех группах обнаружен нейтрофильный сдвиг влево за счет повышения палочкоядерных нейтрофилов и снижения количества лимфоцитов на фоне лейкоцитоза.

При анализе иммунного статуса коров в опытной группе, пролеченных альве-солом, по сравнению с первичным иммунным статусом до лечения, были отмечены: тенденция к снижению лейкоцитоза (с 11,3±0,61 до 8,15±0,98·109 г/л, р<0,05) за счет снижения уровня нейтрофилов в крови (с 60,0±2,42 % до 48,1±1,46 %, р<0,01); снижение палочкоядерных форм нейтрофилов (с 14,0±2,24 до 4,1±0,96 %, р<0,01); нормализация уровня лимфоцитов (с 30,7±3,18 % до 41,0±3,22 %, р<0,05) ( рисунок ).

Рисунок – Динамика содержания лейкоцитов в крови при применении альвесола до и после лечения субклинического мастита у коров

В контрольной группе необходимо отметить достоверное повышение количества лейкоцитов (с 11,8±0,85 до 14,6±0,82·109 г/л, р<0,05), повышение числа нейтрофилов (с 54,0±1,95 до 59,8±1,38 %, р<0,05), повышение числа палочкоядерных нейтрофилов (с 10,3±1,56 до 17,8±1,15 %, р<0,01). Эти изменения свидетельствуют о прогрессировании воспалительного процесса в тканях вымени.

В составе субпопуляций лимфоцитов после лечения альвесолом субклинического мастита у коров опытной группы обнаружено достоверное снижение содержания CD3+ лимфоцитов (с 1,91±0,06 до 1,42±0,08·109г/л, р<0,05) ( табл. 3 ). В тоже время отмечено достоверное повышение иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+ (с 1,71±0,19 до 2,26±0,31, р<0,05) за счет увеличения концентрации CD4+–лимфоцитов (с 40,3±1,65 % до 45,5±1,48 %, р<0,05) без достоверного изменения количества CD8+–клеток, что свидетельствует об активации клеточного звена иммунитета. Согласно данным таблицы, CD16 (NK-лимфоциты) в опытной группе после лечения достоверно повысился (с 8,8±0,45 до 10,4±0,38 %, р<0,05).

Таблица 3 ‒ Определение популяций Т- и В-лимфоцитов и субпопуляций Т-лимфоцитов у коров с субклиническим маститом до и после лечения

Показатели	Группы (n=8)
	до лечения	контроль	после лечения	контроль
	опыт		опыт
Cluster of differentiation
CD3,109г/л,	1,91±0,06	1,85±0,08	1,42±0,18*	1,77±0,04
--------------, %	55,0±3,46	55,1±4,12	43,5±2,72*	53,9±2,88
CD4,109 г/л,	1,40±0,02	1,42±0,05	1,52±0,08	1,39±0,06
--------------, %	40,3±1,65	42,3±1,72	45,5±1,48*	42,3±2,02
CD8,109г/л,	0,82±0,12	0,78±0,18	0,67±0,16	0,95±0,12
--------------, %	23,6±1,85	23,2±1,12	20,0±1,16	28,9±1,12
CD16,109г/л	0,35±0,08	0,32±0,04	0,27±0,09	0,35±0,08
--------------, %	8,8±0,45	9,5±0,48	10,4±0,38*	7,6±0,28
CD19, %	0,72±0,09	0,86±0,08	0,66±0,08	0,92±0,05
CD25,109 г/л	3,2±0,18	2,9±0,16	2,4±0,14*	3,1±0,24

Показатели	Группы (n=8)
	до лечения	контроль 1,82±0,18	после лечения	контроль 1,46±0,19
ИРИ (CD4/ CD8)	опыт 1,71±0,15		опыт 2,26±0,16*

*- р<0,05, ** - р<0,01 – разница достоверна по сравнению с показателями до лечения.

Этот факт говорит о необходимости изучения противовирусного действия изучаемого препарата. У коров опытной группы установлено достоверное понижение CD25 лимфоцитов (с 3,2±0,18 до 2,4±0,14 %, р<0,05) по сравнению с показателями до лечения. За 5 дней лечения в крови у коров опытной и контрольной групп достоверных изменений уровня CD19+- В-лимфоцитов не обнаружено.

На гуморальное звено иммунитета альвесол не оказал выраженного влияния ( табл. 4 ). Предполагаемого изменения количества IgG и Ig M как в опытной, так и в контрольной группе не зафиксированно.

Таблица 4 – Определение концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов A, M, G у коров с субклиническим маститом до и после лечения

Показатели	Группы (n=8)
	до лечения	контроль	после лечения	контроль
	опыт		опыт
Ig G, г/л	9,0±1,16	8,7±1,03	5,30±1,28	9,65±0,96
Ig А, г/л	0,15±0,08	0,23±0,04	0,83±0,23*	0,45±0,06
Ig М, г/л	0,23±0,08	0,25±0,05	0,13±0,08	0,16±0,06

*- р<0,05, ** - р<0,01 – разница достоверна по сравнению с показателями до лечения.

Эти данные говорят о том, что в опытной и контрольной группах существует повышенный риск хронизации субклинического мастита. Однако за период лечения отмечается достоверное повышение сывороточного IgA (с 0,15±0,08 % до 0,83±0,23 %, p<0,05). Стоит отметить, что уровень IgA не вышел за пределы референсных значений, т.е. произошла его оптимизация.

По данным таблицы 5 , установлено повышение спонтанного НСТ-теста в крови коров опытной группы после проведенного лечения (с 3,16±0,18 до 7,7±1,28, р<0,05) и у коров контрольной группы (с 4,21±0,82 до 6,86±0,68, р<0,05) по сравнению с показателями до лечения.

Таблица 5 – Определение бактерицидной активности нейтрофилов (НСТ-тест) у коров с субклиническим маститом до и после лечения

Показатели	Группы (n=8)
	до лечения	контроль	после лечения	контроль
	опыт		опыт
НСТспонт.	3,16±0,18	4,21±0,82	7,7±1,28*	6,86±0,68*
НСТстим.	45,0±4,56	42,0±4,24	69,0±3,86**	44,0±3,42
Индекс стимуляции	14,0±1,72	9,98±1,12	8,96±1,45*	6,4±1,06*

*- р<0,05, ** - р<0,01 – разница достоверна по сравнению с показателями до лечения.

Мы предполагаем, что активация спонтанного НСТ-теста, вероятно, обусловлена мощной антигенной стимуляцией полиморфноядерных лейкоцитов в условиях стафилококковой антигенемии. В крови коров опытной группы после лечения было отмечено достоверное повышение показателя индуцированного НСТ-теста (с 45,0±4,56 до 68,0±3,86, р<0,01). Согласно научным данным [1, 5], этот факт может свидетельствовать об активизации функционально-метаболической активности нейтрофилов. Однако и в опытной, и в контрольной группах произошло снижение индекса стимуляции нейтрофилов на 35,7 и 40,0 % соответственно. Вероятно, эти изменения связаны со стойким угнетением активности нейтрофильных гранулоцитов. Нейтрофилы становятся не в состоянии метаболизировать свой эффекторный потенциал и нарабатывать активные формы кислорода.

Таким образом, проведенные научные исследования показывают, что применение альвесола при лечении субклинического мастита у коров достоверно способствует активизации клеточного звена иммунитета. Заметных изменений в гуморальном звене иммунитета при лечении субклинического мастита альвесолом в проведенных исследованиях не зафиксировано. Эти данные могут служить поводом для коррекции дозы и длительности курса лечения субклинического мастита альвесолом с целью снижения риска хронизации изучаемой патологии.