Индивидуальная изменчивость быков-производителей (Bos taurus taurus) по устойчивости хроматина спер-матозоидов к криоповреждению

Вспомогательные репродуктивные технологии, в том числе искусственное осеменение, — ключевой элемент современного животноводства (1, 2). Они достигли значительного прогресса и стали основой для программ генетического улучшения сельскохозяйственных животных (3-5). Криоконсервация гамет представляет собой критический технологический этап, который делает эти методы практически реализуемыми и экономически эффективными (6-8). Однако процесс замораживания-оттаивания неизбежно приводит к криоповреждениям, среди которых наиболее значимым с точки зрения оплодотворяющей способности становится нарушение целостности хроматина (9-12).

Стабильность ДНК сперматозоидов рассматривается как комплексный биологический признак, формируемый под влиянием генетических, эпигенетических и физиологических факторов. Наблюдаемая межиндивидуальная вариабельность быков-производителей по устойчивости хроматина к криоконсервации указывает на наличие устойчивого индивидуального компонента этого признака и обусловливает необходимость изучения механизмов, лежащих в его основе (13-15). Следует подчеркнуть, что в рамках настоящего исследования не проводился анализ генетического наследования устойчивости хроматина, а выявленные различия отражают стабильные индивидуальные особенности быков-производителей при стандартизированных условиях содержания и криоконсервации.

Процесс замораживания-оттаивания вызывает два основных типа повреждений ДНК: прямое и косвенное (16-18). Прямое повреждение — это механический разрыв мембран и ядерной оболочки в результате формирования внутриклеточных кристаллов льда (19-21). К косвенному повреждению относится окислительный стресс. При оттаивании спермы резко увеличивается количество активных форм кислорода (22, 23). Сперматозоиды особенно уязвимы к окислительному стрессу из-за высокого содержания ненасыщенных жирных кислот в мембранах и ограниченного объема цитоплазмы, содержащей антиоксидантные ферменты (24, 25). Оценка состояния ядерной ДНК (яДНК) сперматозоидов служит важным фактором, влияющим на их фертильность (26,27). Мета-анализ взаимосвязи фрагментации ДНК сперматозоидов и фертильности мужских особей разных видов показывает отрицательную корреляцию между этими показателями (28-30).

Многочисленные исследования с использованием методов SCSA (sperm chromatin structure assay), TUNEL и комет-анализа демонстрируют, что разные быки-производители, содержащиеся в идентичных условиях и подвергающиеся одинаковым протоколам криоконсервации их гамет, значимо различаются по проценту сперматозоидов с фрагментированной ДНК (DFI) после оттаивания; динамике нарастания повреждений ДНК в процессе последующей инкубации in vitro; устойчивости хроматина к индуцированному окислительному стрессу (31,32).

Эта вариабельность не всегда коррелирует с традиционными параметрами качества спермы (подвижность, морфология), что указывает на независимый генетический контроль стабильности хроматина (33, 34). Процесс спермиогенеза включает замену гистонов на протамины, что приводит к сверхплотной упаковке молекулы ДНК, обеспечивающей ее защиту. Гены, кодирующие протамины (PRM1, PRM2), и их соотношение (P1/P2) критически важны. Полиморфизмы в них ассоциированы с нарушением компактизации и повышенной чувствительностью ДНК к криоповреждению у быков и других видов млекопитающих (35, 36).

В процессе сперматогенеза происходят естественные разрывы молекулы ДНК, которые эффективно репарируются на стадии круглых сперматид. Мутации или полиморфизмы в генах систем репарации (например, в генах MSH4 , MLH1 , участвующих в мейотической рекомбинации, или генах эксцизионной репарации) могут приводить к накоплению нерепарирован-ных повреждений, которые усугубляются при криоконсервации (37). Устойчивость хроматина сперматозоидов к криоконсервации — сложный поли-генный признак, находящийся под значительным генетическим контролем. Индивидуальные генетические особенности быков, влияющие на компак-тизацию ДНК, эффективность репарации и антиоксидантной защиты, служат основным источником вариабельности по этому признаку.

В настоящей работе мы впервые установили тесную связь между площадью и радиусом головки сперматозоидов (R2 = 0,988) как потенциального маркера степени конденсации хроматина.

Нашей целью было выявление и количественная оценка индивидуальных различий быков-производителей по чувствительности сперматозоидов к криоконсервации, а также определение наиболее информативных показателей, отражающих дестабилизацию ядерной ДНК.

Методика. Исследования проводили во Всероссийском НИИ племенного дела в 2025 году. Использовали заморожено-оттаянные образцы спермы быков-производителей ( Bos taurus taurus ) пяти пород (голштинской, симментальской, ярославской, костромской и герефордской), относящихся к молочному, комбинированному и мясному направлениям продуктивности. Всего был исследован 61 бык в возрасте 4-5 лет.

Образцы спермы отбирали в течение всех сезонов года. Содержание животных, сбор эякулятов, условия и протоколы криоконсервации и оттаивания спермы соответствовали требованиям «Национальной технологии замораживания и использования спермы племенных быков-производителей» (38). Функциональное состояние сперматозоидов оценивали методом компьютерного анализа спермы с использованием программного обеспечения Argus-CASA (ООО «АргусСофт», Россия). Для каждого образца спермы определяли основные кинематические параметры движения сперматозоидов: VAP (average path velocity) — средняя скорость движения головки по усредненной траектории движения, мкм/с; VSL (straight-line velocity) — скорость прямолинейного движения головки, мкм/с (средняя скорость движения головки сперматозоида вдоль прямого отрезка между начальной и конечной точкой траектории); VCL (curvilinear velocity) — средняя скорость движения сперматозоидов по реальной траектории движения, мкм/с; ALH (amplitude of lateral head displacement) — среднее отклонение головки, мкм (амплитуда латерального смещения головки сперматозоида от траектории движения); BCF (beat cross frequency) — частота колебательных усредненных движений, Гц (частота пересечений); средняя частота пересечения криволинейной траекторией движения сперматозоида его усредненной траектории за единицу времени, Гц; STR (straightness, VSL/VAP) — степень прямолинейности направленного движения сперматозоидов, % (прямолинейность средней траектории движения), которая рассчитывается по формуле VSL/VAP х 100; LIN (linearity, VSL/VCL, %) — степень волнистости треков, % (величина колебания истинной траектории движения по отношению к средней траектории).

Сперматозоиды делили на следующие классы по подвижности: прогрессивно подвижные (PR, progressive motility) — сперматозоиды, двигаю-362

щиеся активно, либо линейно, либо по кругу большого радиуса, независимо от скорости; непрогрессивно подвижные (NP, non-progressive motility) — все другие виды движений с отсутствием прогрессии, то есть плавающие по кругу небольшого радиуса, жгутик с трудом смещает головку или наблюдается только биение жгутика; неподвижные (IM, immotility).

Для измерения степени повреждения ядерной ДНК сперматозоидов использовали щелочную версию анализа ДНК-комет при pH > 13 (28, 39). Детекцию осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ni-U («Nikon», Япония) и системы визуализации микрофотоизображений ProgRessHFcool/CaputerPro 2.8.8 («Jenoptik AG», Германия).

Для анализа полученных данных использовали программу CASP LAB 1.2.2 («CaspLab», Польша). В качестве критерия поврежденности молекулы ДНК в сперматозоидах (исследовали не менее 100 половых клеток) определяли процент ДНК в голове, хвосте кометы, длину миграции ДНК в хвосте кометы, радиус головы, длину, момент хвоста кометы и момент хвоста по Оливе — интегральный показатель повреждения ДНК.

Момент хвоста рассчитывали по формуле:

МХ = ДХ х %Днк в х 100     ’ где МХ — момент хвоста кометы; ДХ — длина хвоста кометы, мкм; %ДНК в Х — процент ДНК в хвосте кометы.

Длина хвоста кометы — расстояние от центра головы кометы до конца ее хвоста (в пикселях или мкм).

Процент ДНК в хвосте определяли по формуле:

% ДНКвХ = ———х100, н         ИФ в Г+ИФвХ     ’ где ИФвХ — интенсивность флуоресценции в хвосте; ИФвГ — интенсивность флуоресценции в голове.

Момент хвоста по Оливе определяли по формуле;

v х   %ДНК вХ

— Х_г) х -------- ,

^Г7      100 ’

^

МХО = (Х х

^

где МХО — момент хвоста по Оливе; Х_х — средняя длина хвоста; Х_г средняя длина головы кометы.

-- --

Морфометрический анализ головки сперматозоидов включал измерение площади и радиуса, которые рассматривались как количественные характеристики размеров клетки и косвенные индикаторы степени конденсации хроматина. Для создания базы данных использовали Microsoft Excel («Microsoft», США), для статистического анализа — SPSS v.23.0.Statistics («IBM», США) и программное обеспечение R (R Core Team, 2023). Вычисляли средние значения показателей ( M) и стандартные ошибки средних (±SEM). Проверку нормальности распределения остатков осуществляли с помощью критерия Шапиро-Уилка и визуального анализа Q-Q графиков, гомогенность дисперсий оценивали с применением теста Левена.

Учитывая многоуровневую структуру данных, обусловленную анализом большого числа сперматозоидов от разных быков-производителей, для оценки дисперсионных компонентов применяли модели смешанных эффектов с ограниченным максимальным правдоподобием. Фактор «бык-производитель» рассматривали как случайный эффект, что позволяло разделять межиндивидуальную и внутригрупповую вариабельность исследуемых признаков и корректно оценивать вклад устойчивых индивидуальных различий животных. Для количественной характеристики степени согласованности показателей рассчитывали внутриклассовые коэффициенты корреляции с построением 95 % доверительных интервалов методом бутстрэппинга (1000 повторений). Для анализа взаимосвязи между степенью фрагментации ДНК сперматозоидов и параметрами их подвижности применяли канонический дискриминантный анализ. Регрессионный анализ использовали для оценки взаимосвязей между морфометрическими характеристиками головки сперматозоидов. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты. Для количественной оценки доли влияния генетических факторов на устойчивость хроматина к криоконсервации был применен метод смешанных линейных моделей со случайными эффектами. Анализ проводили для четырех ключевых параметров степени фрагментации ДНК: содержания ДНК в хвосте кометы (Tail DNA, %), содержания ДНК в голове кометы и интегрального показателя повреждения хроматина — момента хвоста по Оливе (Olive tail moment) (табл. 1). Применение смешанных линейных моделей позволило дифференцировать вариабельность, обусловленную межгрупповыми различиями между быками, и внутригрупповую изменчивость.

1. Описательная статистика и параметры смешанных моделей показателей, характеризующих целостность ДНК сперматозоидов у быков-производителей ( Bos taurus taurus ) пяти пород (Всероссийский НИИ племенного дела, 2025 год)

Показатель	ДНК в голове кометы, %	ДНК в хвосте кометы, %	Момент хвоста кометы	Момент хвоста по Оливе
M ±SEM ( n = 3)	98,24±0,190	1,76±0,270	0,25±0,009	0,26±0,006
Случайный эффект	10,22	10,22	0,000	1,04x10 - 2»
(дисперсия)	(p < 0,001)	(р = 0,608)	(p < 0,001)	(р < 0,001)
Остаточная дисперсия	20,44	20,44	0,119	0,125
Общая дисперсия	30,66	30,66	0,119	0,125
Внутриклассовый коэф-
фициент корреляции	0,33	0,33	0,00	0,00

Содержание ДНК в голове кометы имело высокое среднее значение (98,24±0,190 %), что свидетельствует о целостности ДНК в большинстве сперматозоидов. Низкое значение стандартной ошибки среднего (±0,190) указывало на высокую точность оценки параметра. В противоположность этому, доля ДНК в хвосте кометы составляла всего 1,76±0,270 %, что логично соответствует принципу комплементарности этих двух показателей.

Для величины момента хвоста (0,25±0,009) и момента хвоста по Оливе (0,26±0,006) были характерны относительно низкие абсолютные значения, но существенно б о льшая относительная ошибка измерения, что может отражать более высокую вариабельность этих интегральных показателей.

Результаты анализа компонент дисперсии свидетельствовали о наличии принципиальных различий в структуре вариации исследуемых параметров. Для содержания ДНК в голове кометы была обнаружена статистически значимая дисперсия случайного эффекта (10,22; p < 0,001), что свидетельствует о наличии достоверных различий между быками по этому показателю. Остаточная дисперсия (20,44), отражающая вариабельность сперматозоидов у каждого быка (внутрииндивидуальная изменчивость), существенно превышала дисперсию, обусловленную различиями между быками (межиндивидуальная изменчивость). Следовательно, основным источником вариации для этого параметра служит разнородность сперматозоидов в эякуляте, а не устойчивые различия между быками. Общая дисперсия составляла 30,66. Расчет внутриклассового коэффициента корреляции (ICC), где в качестве классов рассматривались отдельные быки-производители, позволил количественно оценить долю вариабельности показателей, обусловленную устойчивыми индивидуальными различиями между животными.

Для содержания ДНК в голове и хвосте кометы ICC составлял 0,33, то есть 33 % общей вариабельности этих показателей было обусловлено 364

индивидуальными различиями между животными, а 67 % — внутрииндиви-дуальной вариабельностью.

Характер движения сперматозоидов служит важнейшим показателем, отражающим биологическую полноценность спермы и зависящим от многочисленных факторов биотической и абиотической природы. Для изучения взаимосвязи между повреждением ДНК сперматозоидов и характером их движения был применен дискриминантный анализ. Все образцы спермы в зависимости от степени фрагментации ДНК, количественно оцененной с помощью метода ДНК-комет, были разделены на три группы: с низкой, средней и высокой степенью повреждения (табл. 2).

2. Параметры подвижности сперматозоидов, полученных от быков-производителей ( Bos taurus taurus ) пяти пород, в группах с различной степенью повреждения ДНК ( M ±SEM; Всероссийский НИИ племенного дела, 2025 год)

Степень повреждения ДНК	Содержание сперматозоидов, %
	прогрессивно подвижных	с непрямолинейным движением	неподвижных
Низкая ( n = 6416)	33,36±0,14	3,06±0,04	63,58±0,15
Средняя ( n = 746)	33,23±0,43	3,27±0,10	63,50±0,43
Высокая ( n = 431)	33,15±0,53	3,57±0,10	63,28±0,53
Всего ( n = 7593)	33,33±0,13	3,11±0,03	63,56±0,13

Анализ средних значений в зависимости от степени повреждения ДНК показал, что они были весьма близки друг к другу во всех трех группах. Наибольшее видимое различие между группами наблюдалось для переменной «содержание сперматозоидов с непрямолинейным движением», среднее значение которой монотонно возрастало от группы с низким к группе с высоким повреждением. Проверка предпосылок дискриминантного анализа выявила критические ограничения. Тест на равенство групповых средних (критерий Уилкса) показал, что статистически значимые различия между группами присутствовали только для переменной «содержание сперматозоидов с непрямолинейным движением», в то время как для переменных «содержание сперматозоидов с прямолинейным движением» (р = 0,910) и «содержание неподвижных сперматозоидов» (р = 0,861) различия оказались незначимыми. В результате дискриминантного анализа была получена статистически значимая каноническая функция ( X Уилкса = 0,998, х ² = 14,724, р = 0,005). Анализ стандартизованных коэффициентов и матрицы структуры функции показал, что она полностью определяется переменной «содержание сперматозоидов с непрямолинейным движением» (коэффициент = 0,996, корреляция = 0,999).

Функциональные характеристики сперматозоидов, включая их способность переносить криоконсервацию, в значительной степени определяются структурной целостностью и морфологией клетки (40). Нарушение целостности акросомы и дестабилизация ядерной ДНК часто сопутствуют изменениям размеров и формы головки сперматозоида, поскольку эти структуры формируются в процессе спермиогенеза как элементы единого морфофункционального комплекса клетки. Степень конденсации хроматина влияет на пространственную организацию ядра, что может косвенно отражаться на морфометрических характеристиках головки сперматозоида.

В связи с этим представляет интерес исследование базовых морфометрических параметров в качестве потенциальных маркеров структурной стабильности. Площадь и радиус головки служат ключевыми количественными дескрипторами, характеризующими размер клетки. Анализ морфометрии головки необходим для изучения влияния индивидуальных особенностей быков-производителей на стабильность хроматина сперматозоидов в процессе замораживания-оттаивания, поскольку размер головки косвенно отражает степень конденсации хроматина (41).

Для изучения индивидуальных особенностей каждого быка-производителя был проведен анализ взаимосвязи между площадью и радиусом головки сперматозоидов (рис.).

Регрессионная зависимость между площадью и радиусом головки сперматозоидов (пиксели) у быков-производителей ( Bos taurus taurus ) пяти пород (Всероссийский НИИ племенного дела, 2025 год) . На рисунке каждая группа представляет собой сперматозоиды одного быка-производителя. Группировка выполнена строго по принципу один бык — одна группа.

Тесная связь между площадью и радиусом головки подтверждает базовую биологическую закономерность строения сперматозоидов. Анализ графика показал межиндивидуальную вариабельность морфометрических показателей. Формирование отдельных групп со смещенными показателями (в частности, группы «Дейв-Круиз») указывало на связь между морфологией сперматозоидов и индивидуальными особенностями быков-производителей. Разный разброс точек внутри групп свидетельствовал о неодинаковой степени морфологической однородности сперматозоидов у разных быков-производителей. В комплексе с данными о подвижности и стабильности хроматина показатели площади и радиуса головки позволяют проводить поиск интегрированных маркеров и строить комплексные прогностические модели. Такой подход способствует идентификации быков-производителей, сперматозоиды которых обладают высокой устойчивостью к денатурации хроматина, индуцированной процессом криоконсервации.

Следует подчеркнуть, что выявленная в настоящем исследовании индивидуальная вариабельность быков-производителей по показателям стабильности хроматина сперматозоидов не может рассматриваться как результат исключительно генетической детерминации. Стабильность ядерной ДНК — это сложный полигенный признак, формируемый под влиянием физиологического статуса животного, условий сперматогенеза, окислительного стресса и особенностей протоколов криоконсервации (22, 23, 40). Вместе с тем сохранение статистически значимых межиндивидуальных различий при стандартизированных условиях содержания животных и обработки спермы указывает на наличие устойчивого индивидуального компонента вариабельности, который может включать наследственную составляющую.

Таким образом, у быков-производителей выявлена выраженная индивидуальная вариабельность по показателям фрагментации ядерной ДНК сперматозоидов после криоконсервации, сохраняющаяся при стандартизированных условиях содержания и обработки спермы. Доля межиндивидуальной вариабельности по содержанию ДНК в голове кометы составляла 33 %, что указывает на наличие устойчивого индивидуального компонента вариабельности у этого признака. Параметры подвижности сперматозоидов в целом слабо дифференцируют по степени повреждения ДНК, за исключением доли сперматозоидов с непрямолинейным характером движения, которая возрастает при увеличении фрагментации ДНК. Морфометрические характеристики головки сперматозоидов (площадь и радиус) демонстрируют тесную взаимосвязь и отражают устойчивые индивидуальные морфологические особенности сперматозоидов быков-производителей, потенциально связанные со степенью конденсации хроматина. Полученные данные подтверждают целесообразность комплексной оценки фрагментации ДНК, подвижности и морфометрических характеристик сперматозоидов при разработке критериев определения криорезистентности спермы и отбора быков-производителей.

ФГБНУ Всероссийский НИИ племенного дела,