Влияние качественных показателей сперматозоидов на оплодотворяемость ооцитов в условиях in vitro

Актуальность

Способность спермы быка-производителя к оплодотворению яйцеклетки является важным показателем эффективности воспроизводства крупного рогатого скота. Достоверно доказано, что в России и за рубежом большая часть производителей поставляют в хозяйства низкокачественную в биотехнологическом отношении сперму быков производителей. Спермии либо погибают в процессе оттаивания или замораживания, либо теряют свою оплодотворяющую способность от прочих причин [1‒5].

Методы улучшения качества спермы животных предложены J. M. Morrell и H. Rodriguez-Martinez. Известно, что на качественные показатели спермы влияет состав разбавителя. J. M. Morrell и M. Wallgren считают, что имеются альтернативные варианты замены антибиотикам, входящих в разбавитель [4, 5].

Разработки в области криобиологии, репродуктивных технологий и охранной геномики могут формировать стратегии генного банка для сельскохозяйственных животных [6, 7]. Исследователями предложена оценка повреждений сперматозоидов на разных этапах криоконсервации у водяных буйволов с помощью флуоресцентных зондов [8, 9].

В опытах по изучению воздействия кофеина на функциональность незамороженных спермиев быков и после консервации. Авторами отмечено, что «в интактных незамороженных спермиях быков инкубация в течение 4 ч в присутствии кофеина приводила к росту числа капаци-тированных и акросома-реактивных клеток» [10].

Была также изучена интрацитоплазматическая трансдукция кальция в сперматозоидах BOS TAURUS при капацитации и акросомной реакции [11].

Исследования в направлении по улучшению качественных показателей спермы ведутся учеными всего мира, и к настоящему времени уже достигнуто множество положительных моментов [8, 10, 12, 19, 24].

Замораживание и хранение спермы в жидком азоте – это важнейший метод увеличения репродуктивных способностей животных, однако оплодотворяющая способность замороженных спермиев до настоящего времени остается низкой [13, 14].

Для замораживания и хранения спермы в жидком азоте используются разнообразные среды, которые состоят из различных компонентов, в том числе из молока. По сообщению ряда авторов, «содержание сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением после оттаивания с использованием молочной среды составляет более 50%» [15, 16, 17].

Исследования В.В. Никулина, С.М. Боруновой, Б.С. Иолчиева и др. (2018), показали, что «для эффективной и достоверной оценки замо-рожено-оттаянной спермы быков-производителей с молочным разбавителем необходимо использовать витальный флуоресцентный анализ с применением красителя Hoechst 33342» [18].

В настоящее время большое внимание сосредоточено на изучении генетического материала и препаратов на соответствие их стандартам качества, в том числе проводятся исследование спермы. Разработка рекомендаций по определению целостности акросомы спермиев, с при- менением тест-набора красителей Дифф-Квик, ФГБУ «ВГНКИ (Всесоюзный государственный научно контрольный институт ветеринарных препаратов)» совместно с сотрудниками ФБГУ «ВИЖ (Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства) им. Л.К. Эрнста», позволяет дать более точное прогнозирование оплодотворяющей способности спермиев. Ученые отмечают, что «методика окраски, указанная в ГОСТ 32277-2013, не отвечает современным требованиям определения целостности акросомы сперматозоида, а краситель эозин/ нигрозин советуют применять только для установления количественных показателей мертвых и живых спермиев» [18].

Е.Н. Новикова, И.С. Коба, А.В. Скориков, О.О. Аль-равашдех отмечают, что «основной причиной бесплодия животных является нарушение технологии содержания, кормления и осеменения коров». Оптимальным считается сервис-период от 60 до 110 дней, а более 140 дней наблюдают у проблемных животных. Определено, что стельность от первичных осеменений должна составлять 50‒60 % [19].

Для успешного развития животноводства, как с применением метода искусственного осеменения, так и при внедрении современных биотехнологических методов воспроизводства, важно наряду с оценкой быков по качеству потомства, учитывать и качественные характеристики семени, влияющие на оплодотворяющую способность [20, 21, 22]. В этом отношении становится актуальным изучение качественных характеристик семени быков-производителей при использовании в методах оплодотворения in vitro.

Цель исследований. Изучить влияние качественных показателей сперматозоидов на оплодотворяемость ооцитов в условиях in vitro.

Задачи:

‒ провести исследования проб заморожено-оттаянной спермы на подвижность (активность), количественные показатели живых и мертвых спермиев, а также определить целостность акросомы спермиев в исследуемых образцах;

‒ определить влияние качественных показателей сперматозоидов на оплодотворяемость ооцитов in vitro.

Материалы и методы исследований

Экспериментальные исследования проводили в научно-исследовательской лаборатории «Биохимических, молекулярно-генетических исследований и селекции сельскохозяйственных животных» ФГБОУ ВО Кузбасской ГСХА.

Исследования проводили на заморожено-оттаянной сперме быков-производителей голштинской черно-пестрой породы: Аллегро-106303101; Матиас-4593; Набег-1896.

Образцы спермы для исследования приобретали в АО «Кемерово-плем» Кемеровская область, п. Ясногорский. Сперма поступала в замороженном виде в пайетах в сосуде Дьюара при температуре -196 ºС. Исследовали по 10 проб спермы от каждого быка.

На активность проверяли сперму согласно ГОСТ 32277-2013 «Средства воспроизводства. Сперма. Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов». Визуально под микроскопом в раздавленной капле спермы определяли количественное соотношение сперматозоидов, имеющих прямолинейное поступательное движение (ППД) к их общему количеству.

Для использования допускается сперма, в которой содержание сперматозоидов с ППД (прямолинейно-поступательным движением) не ниже 40 % (ГОСТ 26030-2015 «Сперма быков замороженная. Технические условия»).

При определении показателей живых и мертвых спермиев, проводили окрашивание раствором эозина и определяли по формуле:

где С + – количество сперматозоидов с окрашенными головками, шт.;

С- ‒ количество сперматозоидов с неокрашенными головками, шт.

Для определения целостности акросомы сперматозоидов применяли тест-набор красителей Дифф-Квик, состоящий из фиксатора, раствор 2 ‒ розовый, раствор 3 – синий и буфера Г (по 1 флакону каждого). Производитель НПФ «АБРИС+», Россия, Санкт-Петербург. Оценку результатов проводили по ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

Работы, связанные с получением, подготовкой и оплодотворением ооцитов in vitro проводили согласно методике «Экстракорпоральное оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота» [23].

Ооциты для проведения эксперимента были получены от коров-доноров путем аспирации из яичников живых животных под контролем УЗИ (ovum-pick-up (OPU)) на животноводческом предприятии ООО «Селяна» Кемеровской области.

В лаборатории ооциты промывали 3 раза в среде ТС-199, содержащей 5 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 10 мкг/мл гепарина, 0,2 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина. Для оценки были отобраны ооциты округлой формы, с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компактным кумулюсом. Для оплодотворения отбирали предварительно оцененные ооциты хорошего и отличного качества [23].

Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере с помощью программы Microsoft Оffice Excel с подтверждением достоверности по критерию t-Стьюдента в следующих значениях: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Результаты исследований

Анализ результатов исследования показал, что пробы спермы быка Аллегро-106303101 имели активность 33,0±2,30 % с прямолинейно-поступательным движением спермиев (3,3 балла), сперма быка Матиас-4593 с поступательным движением 42,0±2,10 % (4,2 балла), сперма быка Набег-1896 с поступательным движением 35,0±2,5 % (3,5 балла).

Показатели активности сперматозоидов быка Матиас-4593 достоверно превосходили показатели спермы от быков Аллегро-106303101 на 9 % (p<0,01) и Набег-1896 на 7 % (p<0,05) (табл. 1) .

Таблица 1 — Результаты исследования спермы при определении активности

№ п/п	Кличка и номер быка-производителя	Средний показатель активности, %	Средний показатель, балл
1	Аллегро-106303101	33,0±2,3	3,3
2	Матиас-4593	42,0±2,101**3*	4,2
3	Набег-1896	35,0±2,5	3,5
Примечание: здесь и далее разница достоверна при * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001.

При определении показателей живых и мертвых спермиев были получены следующие результаты: сперма быка Аллегро-106303101 ‒ 1%, быка Матиас-4593 – 0,8%, быка Набег-1896 ‒ 0,9% мертвых спер-миев.

Таким образом, показатели, характеризующие подвижность спер-миев, содержание живых и мертвых спермиев в образцах соответствовали ГОСТ 32277-2013 «Средства воспроизводства. Сперма. Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов».

Для выявления частоты морфологических повреждений структуры акросомы при оттаивании спермы и степени влияния на ее оплодотворяющую способность применяли набор красителей «Дифф-Квик». В ходе исследования определяли содержание сперматозоидов с поврежденной акросомой. Каждую пробу спермы (по 10 проб от быка) исследовали непосредственно после оттаивания, через 1 и 2 часа после размораживания (табл. 2.). Сперматозоиды крупного рогатого скота, с поврежденной акросомой, при использовании красителя «Дифф-Квик» окрашивались в светло-розовый цвет, в норме - в коричневый [20].

Таблица 2 — Результаты исследования спермы при определении целостности акро-сомы

№ п/п	Кличка и номер быка-производителя	Средний показатель (норма по ГОСТ -50%)
1	Аллегро-106303101	36,3±2,22**
2	Матиас-4593	25,2±1,8
3	Набег-1896	32,7±2,72*

Показатели, представленные в таблице, указывают на достоверную разницу по изучаемому показателю между образцами спермы быков. Нами установлено, что в пробах спермы быка Матиас-4593, выявлен меньший процент спермиев с поврежденными акросомами. В среднем, этот показатель отмечен на уровне 25,2±1,8 %, что может свидетельствовать о высоком качестве спермы.

Больший процент поврежденных акросом отмечен в пробах спермы быка Аллегро-106303101, который в среднем составил 36,3±2,2 %, что выше, чем в пробах спермы Матиаса-4593 на 11,1 % (p<0,01) и Набега-1896 на 3,6 %, где этот показатель отмечен на уровне 32,7±2,7 %. Разница между пробами спермы быков Набег-1896 и Матиас-4593 достоверно разнилась и составила 7,5 % (p<0,05). При определении целостности акросом сперма быка Матиас-4593 отличается лучшими характеристиками.

Таким образом, исходя из результатов исследований, по 3-м показателям (подвижность, показатель живых и мертвых спермиев, а также целостность акросомы) сперма быков-производителей Аллегро-106303101, Матиас-4593, Набег-1896 соответствовала норме, но имелись определенные различия по изучаемым показателям, что возможно было связано с условиями получения и использования замороженной спермы.

Результаты оплодотворения in vitro, представленные в таблице 3, показали различную оплодотворяющую способность спермы изучаемых быков. Полученные в опыте результаты свидетельствуют, что наиболее высокие показатели оплодотворения ооцитов in vitro, с использованием спермы быка Матиас-4593, где получено 5 удачных оплодотворений из 10 (50 %). Более высокие показатели полученного процента оплодотворения in vitro спермой быка Матиас-4593 мы связываем лучшим показателем активности спермиев (42,0±2,10 %) и меньшим содержанием спермиев с поврежденной акросомой (25,2±1,8 %).

Таблица 3 ‒ Результаты оплодотворения ооцитов in vitro

Кличка и номер быка-произво дителя	Показатели оплодотворения in vitro
	Количество	Нормальное оплодотворение	Отсутствие оплодотворения (партено генез или 1 пронуклеус)	Полис пермия (больше, чем 3 прону клеуса)	Всего
Аллегро-	n	4	5	1	10
106303101	%	40	50	10	100
Матиас-	n	5	3	2	10
4593	%	50	30	20	100
Набег-	n	4	4	2	10
1896	%	40	40	20	100

Заключение

Как показывают результаты российских и зарубежных исследователей, качество спермопродукции зависит от целого ряда факторов. При несоблюдении условий получения, замораживания, хранения и оттаивания спермы качественные характеристики заметно снижаются, что оказывает негативное влияние на оплодотворяющую способность сперматозоидов [3, 10, 12, 16, 24].

В ходе наших исследований было установлено, что пробы спермы быков производителей имели активность от 33,0±2,3% (3,3 балла) до 42,0±2,10 % (4,2 балла), показатели живых и мертвых спермиев при окрашивании эозином от 0,8 до 1 %, что соответствует ГОСТ № 32277–2013. Целостность акросомы спермиев в 3-х исследованиях соответствовала норме и в среднем отмечена на уровне от 25,2±1,8 до 36,3±2,2 %. Более лучшие результаты при оплодотворении ооцитов in vitro (50 % оплодотворений) получены при использовании спермы быка Матиас-4593, возможно на это повлияли качественные показатели спермы, такие как активность (42,0±2,10 %) и количество спермиев с поврежденной акросомой (25,2±1,8 %).