Исследование адгезивной активности микробного консорциума

Введение. Молочнокислые бактерии широко применяются в фармацевтической и пищевой отрасли. Важнейшей функцией молочнокислых бактерий является синтез молочной кислоты, которая снижает рН среды, губительно действующей на развитие гнилостной и патогенной микрофлоры. Побочные продукты метаболизма, такие как экзополисахариды, пировиноградная кислота, диацетил и др., влияют на формирование консистенции, вкуса и аромата кисломолочных продуктов. Молочнокислые бактерии используются в медицине. Употребление пробиотиков нормализует работу желудочнокишечного тракта, препятствует ее заселению условно-патогенными микроорганизмами и улучшает состояние слизистой оболочки [1]

Для проявления пробиотических свойств молочнокислыми бактериями необходимо формирование ассоциаций с эпителиальными клетками ЖКТ хозяина. Основным процессом, обеспечивающим взаимоотношения макро- и микроорганизмов, является адгезия. Адгезивность бактериальных клеток – это один из механизмов защитного действия. Благодаря адгезии молочнокислые бактерии могут успешно конкурировать c энтеропатогенными бактериями за рецепторы связывания эпителиальных клеток слизистой оболочек [2, 3].

Известно, что спонтанно сформированные бактериальные биопленки характеризуются высокими адгезивными свойствами. Биопленки представляют естественную иммобилизацию клеток, обладающую колонизационной резистентностью [3–5].

Этими свойствами обладает спонтанно сформированная популяция микроорганизмов кисломолочных продуктов, таких как кефир, ку-рунга и кумыс. Микрофлора перечисленных кисломолочных продуктов представляет симбиоз термофильных и мезофильных лактобактерий, дрожжей, ацетобактерий, обладающих высокой антагонистической активностью к патогенной и гнилостной микрофлоре [6].

Нами разработан способ получения закваски, идентичной по составу естественной популяции микрофлоры курунги и кумыса [7].

Цель работы . Исследование адгезивной активности полученного микробного консорциума.

Задачи : исследовать адгезивную активность исходных компонентов, применяемых для создания микробного консорциума; изучить механизм формирования адгезивных свойств микробного консорциума.

Объекты и методы исследования . В качестве объекта исследования использовали микробный консорциум, полученный путем длительного культивирования комбинированной закваски, состоящей из кефирной грибковой закваски, Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus bulgaricus и Lactobacillus helveticus в соотношении 1:0,5:0,5:0,5 [6].

Для получения кефирной грибковой закваски и лабораторных заквасок L. acidophilus, L. bulgaricus и L. helveticus использовали сухие кефирные грибки и промышленные сухие закваски, произведенные ООО «Барнаульская биофабрика».

Адгезивные свойства микроорганизмов в зависимости от поставленных задач исследовали экспресс-методом или развернутым методом по методике Брилиса [8]. В качестве клеток макроорганизма использовали эритроциты человека. Поверхность эритроцитов близка поверхности эпителиальных клеток, на которых размещены рецепторы для адгезинов микробов. Исследуемые культуры выращивали в МПБ в течение 48 ч, полученную биомассу отделяли от культуральной среды центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. К осадку добавляли буферный раствор 0.1 М – раствор натрия фосфата.

ИАМ (индекс адгезивности микроорганизмов) вычисляли по формуле

ИАМ = СПА ∙100, К, где СПА – средний показатель адгезии; К – коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе.

Количественный учет лактобактерий и дрожжей определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) при высеве клеточных суспензий из соответствующих разведений на селективные питательные среды.

Результаты исследования и их обсуждение . При исследовании адгезивных свойств исходных культур, применяемых для получения микробного консорциума, использовали экспресс-метод. Взвесь микроорганизмов и эритроцитов на предметном стекле термостатировали в течение 30 мин при (42 + 2)°C с термофильными молочнокислыми палочками и при (22 + 2)°С с кефирной грибковой закваской. Результаты исследования представлены в таблице.

Показатели адгезии исходных компонентов микробного консорциума

Культура	СПА, клеток	К, % эритроцитов	ИАМ, кл/эр
L. acidophilus	3,3	78	2,9
L. bulgaricus	1,73	72	2,4
L. helveticus	0,61	71	0,85
Кефирная грибковая закваска	3,01	81,6	3,68

Данные таблицы свидетельствуют, что исследуемые чистые культуры и кефирная грибковая закваска относятся к среднеадгезивным, а L. helveticus проявил низкие адгезивные свойства по отношению к эритроцитам.

Для приготовления кефирной грибковой закваски и инокулятов чистых культур использовали обезжиренное молоко по ГОСТ 520542003, не ниже первого сорта. Для приготовления кефирной грибковой закваски в пастеризованное при 85 °С с выдержкой 15 мин, охлажденное до 20 °С молоко вносили активизированные кефирные грибки в соотношении 1 г грибка на 50 мл молока. Для получения инокулятов чистые культуры вносили в стерилизованное при

100 °С с выдержкой 5 мин, охлажденное до 42 °С молоко. Культивирование проводили в отдельных для каждой закваски колбах при 20 °С (кефирная грибковая закваска), при 42 °С ( L. acidophilus , L. bulgaricus и L . helveticus ).

Затем полученные кефирную грибковую закваску и закваски чистых культур L. acidophilus , L. bulgaricus и L. helveticus смешивали в соотношении 1:0,5:0,5:0,5 и культивировали в течение 72 ч при 30 °С.

Исследовали динамику популяции микрофлоры кефирной грибковой закваски и термофильных молочнокислых палочек в течение 72 ч термостатирования при 30 °С.

• □    мезофильные молочнокислые палочки;

• □    термофильные молочнокислые палочки;

• □    ацетобактерии;

• □    стрептококки;

я дрожжи, сбраживающие лактозу

Время,ч

Рис. 1. Динамика популяции микрофлоры кефирной закваски и термофильных лактобактерий в процессе автоселекции

Из данных рисунка 1 видно, что условия автоселекции приводят к уменьшению количества стрептококковой микрофлоры кефирной грибковой закваски и термофильных молочнокислых палочек. Вместе с тем благоприятно влияют на развитие мезофильных палочек и дрожжей, не сбраживающих лактозу. Основными факторами, регулирующими формирование микробного консорциума процесса, являются температура и активная кислотность среды.

Далее были исследованы адгезивные свойства микробного консорциума в процессе автоселекции. Результаты исследования представлены на рисунке 2.

Рис. 2. Влияние рН среды на адгезивные свойства микробного консорциума

Из рисунка 2 видно, что снижение рН среды способствует увеличению количества микробных клеток, прикрепленных на одном эритроците. В начале автоселекции, в течение 24 ч, наблюдается резкое снижение активной кислотности среды от 4,7 до 3,6. Это связано с присутствием большого количества термофильных лак- тобацилл (8·109кое/см3) в микрофлоре комбинированной закваски. Резкое снижение рН создает критические условия для развития многих видов микроорганизмов, входящих в состав комбинированной закваски. В течение 72 ч культивирования комбинированной закваски, состоящей из кефирной грибковой закваски, L. acidophilus,

L. bulgaricus и L. helveticus в соотношении 1:0,5:0,5:0,5 индекс адгезивности повышается до 5,4 кл/эр и превосходит показатели адгезив- 6. ности исходных компонентов.

Выводы . На основании полученных результатов можно утверждать, что изменения адгезивности микроорганизмов зависят от условий 7. культивирования. Этот факт также подтверждается литературными данными в области изучения микробной экологии человека и создания пробиотических препаратов. Одной из причин 8. формирования микробных сообществ является способ их защиты от неблагоприятных внешних факторов. Действительно, микроорганизмы в сообществах более устойчивы к различным воздействиям: изменениям рН, температуры, лимитированию субстратами и др. В таких сообществах между видами конкуренции не суще- 1. ствует [1–6]

Адгезивные свойства являются одним из показателей эффективности действия пробиотических микроорганизмов. Полученные результа- 2. ты исследования свидетельствуют о возможности применения микробного консорциума для разработки уникальных симбиотических бактериальных биологически активных добавок к пище, предназначенных для нормализации мик-  3.

рофлоры ЖКТ.