Исследование антиоксидантной активности средства "Фитотон" в модельных системах in vitro

Известно, что развитие целого ряда патологических состояний организма человека сопровождается усилением образования активированных кислородных метаболитов (АКМ) и свободных радикалов, которые могут вызвать повреждение биологически важных молекул и, в конечном итоге, привести к гибели клетки [1; 5; 14]. Так, установлено, что свободнорадикальное окисление и, в частности, пероксидное окисление липидов (ПОЛ) играет важную роль в патогенезе инфаркта миокарда, атеросклероза, злокачественного роста бронхолегочных и других заболеваний. Кроме того, активация реакций свободнорадикального окисления может наблюдаться при воздействии на организм человека ряда внешних факторов, например, ионизирующей радиации, УФ-излучения, гипербарической оксигенации, озона, табачного дыма, промышленных пылей [2; 10; 11].

В норме регуляция продукции АКМ и свободных радикалов в тканях и органах человека осуществляется многоуровневой физиологической антиоксидантной системой, которая включает в себя соединения различной химической природы: витамины, пигменты, гормоны, ферменты. Несмотря на высокую эффективность антиоксидантной системы, она не всегда способна защитить организм человека от развития оксидантного стресса [10; 13]. В связи с этим одним из приоритетных направлений свободнорадикальной биологии и медицины является создание препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами, с целью их применения для профилактики и лечения заболеваний, сопровождающихся усилением свободнорадикальных реакций. Широкие перспективы для практического использования в качестве лекарственных средств антиоксидантного действия представляют комплексные фитосредства, характеризующиеся наличием в своем составе биологически активных веществ. Как известно, растительные средства характеризуются широким спектром фармакологических свойств, обладающих низкой токсичностью и отсутствием побочных эффектов при длительном приеме [6].

В Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН разработано комплексное растительное средство, условно названное «Фитотон». Установлено, что указанное средство обладает выраженной адаптогенной активностью, повышает сопротивляемость организма животных к действию экстремальных факторов различной природы: интенсивной физической нагрузки, гипоксии и др. [8].

Целью настоящей работы является определение антиоксидантной активности комплексного средства «Фитотон» в модельных системах in vitro .

Материалы и методы

«Фитотон» представляет собой сироп с 15 %-ным содержанием экстрактов сухих растений: Fili-pendula ulmaria (L.) Maxim (стебли и листья), Bergenia crassifolia (L.) Fritsch. (листья) и Mentha piperita L. (стебли и листья) в соотношениях 1:1:1. Растительное сырье соответствовало требованиям фармакопейных статей [3].

Антирадикальную активность определяли с применением DPPH-метода [15]. Влияние исследуемого средства на связывание супероксидных анион-радикалов (О 2 ^∙-) оценивали в неэнзиматической

Т.Б. Смагулова, А.А. Торопова, С.В. Лемза, С.М. Николаев. Исследование антиоксидантной активности средства «Фитотон» в модельных системах IN VITRO системе феназин метосульфат /НАДН [9]; Fe2+-хелатирующую активность определяли фенантролиновым методом [7]; связывание молекул оксида азота (NO) нитропрусидным методом [12]. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности.

В работе использовали кверцетин (Fluka) и аскорбиновую кислоту (Sigma). Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре UV-Vis-mini (Shimadzu) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Корреляционный анализ проводили с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.11 (Alentum Software Inc.), статистическую обработку – согласно рекомендациям [4].

Результаты и их обсуждение

В модельных системах in vitro , в которых происходила генерация свободных радикалов, исследуемое средство «Фитотон» проявляло выраженную антиоксидантную активность (табл. 1).

В эксперименте показано, что «Фитотон» обладает антирадикальной активностью в отношении DPPH-радикала (ДФПГ-метод) – IC 50 = 23,05 мкг/мл. Для препарата сравнения – аскорбиновой кислоты – данный показатель составляет 4.81 мкг/мл.

При изучении влияния исследуемого средства на ряд активных форм кислорода (О 2 ^▪- и NO) и ионы Fe²⁺ выявлено, что комплексное средство «Фитотон» проявляет способность к их инактивации (табл. 1). В эксперименте по определению хелатирования ионов Fe²⁺ установлено, что величина его 50 %-ного ингибирования Fe²⁺ составляет 0.352 мг/мл (IC 50 = 0.352 мг/мл), что превышает активность препарата сравнения – кверцетина (IC 50 > 5000 мкг/мл).

В эксперименте показано, что величина 50 % связывания супероксид анион-радикала для исследуемого средства составляет 25.50 мкг/мл (IC 50 = 25.50 мкг/мл), а для препарата сравнения – аскорбиновой кислоты и кверцетина данный показатель составляет 101.00 и 31.82 мкг/мл соответственно. Таким образом, испытуемое фитосредство обладает выраженной активностью в отношении супероксид анион-радикала кислорода. Данное явление обусловлено, вероятно, присутствием флавоноидов.

Таблица 1

Антиоксидантная активность комплексного средства «Фитотон» а

Объект DPPH, IC50, мкг/мл Fe2+, IC50, мкг/мл O2•-, IC50, мкг/мл NO, IC50, мкг/мл «Фитотон» 23.05±0.23 352.00±0.15 25.50±0.79 630.00±19.01 Кверцетин б 9.85±0.18 > 5000 31.82±1.02 149.77±3.59 АК б 4.81±0.15 150.00±0.01 101.00±3.21 1140.00±34.21 а DPPH – антирадикальная активность в отношении ДФПГ-радикала, Fe2+ – Fe2+-хелатирующая активность, О2•- – связывание супероксид-анион радикала, NO – связывание молекул оксида азота (II); б вещество сравнения

Также в условиях in vitro , показано, что комплексное средство «Фитотон» до концентрации 1.50 мг/мл обладает более высокой связывающей способностью по отношению к NO (IC 50 = 0.63 мг/мл), чем аскорбиновая кислота (IC 50 = 1.14 мг/мл). При дальнейшем увеличении концентрации активность аскорбиновой кислоты резко возрастает. В концентрации 3,0 мг/мл активность исследуемого средства «Фитотон» составляет 65,24% от активности аскорбиновой кислоты той же концентрации.

Представлены результаты исследования антиоксидантных свойств комплексного растительного средства «Фитотон». Установлено, что «Фитотон» обладает выраженной антиоксидантной активностью, обусловленной антирадикальным действием соединений фенольной природы, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот (кофейной, эллагаловой), катехинов, флавоноидов (гиперозид, ави-кулярин, дипентозид кверцетина), входящих в его состав. Установлено, что исследуемое средство проявляет тенденцию к инактивации активных форм кислорода и других инициаторов ПОЛ. Таким образом, испытуемое фитосредство имеет несколько механизмов действия и способно ингибировать процессы свободнорадикального окисления на разных стадиях протекания.