Исследование белков национального мягкого сыра электрофоретическим методом

Введение Электрофоретический метод исследования белка является быстроразвивающимся методом. Результаты электрофореза можно обрабатывать из полученных цифровых изображений геля с помощью сканера или прибора с тепловизором. Количественную оценку белков можно осуществить с помощью компьютерной программы Total Lab 100, которая осуществляет цифровую обработку изображений полосок [1].

Электрофорез в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (ДДС-Na, C] 2 H 25 OS0 3 Na) позволяет фракционировать белки в зависимости от значений только одного параметра — их молекулярной массы. Для этого белки в исходном растворе препарата обрабатывают не менее чем трехкратным избытком ДДС-Na. За счет гидрофобных взаимодействий детергент примерно одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг ДДС-Na на 1 мг белка [2]. Одновременно с обработкой ДДС-Na необходимо обеспечить полную денатурацию белка и разрыв всех S—S-связей. С этой целью белковый препарат обрабатывают высокой концентрацией β-меркаптоэтанола при повышенной температуре [3].

Пробоподготовка включает экстракцию и солюбилизацию белкового образца, который свободен от примесей и имеет общую концентрацию белка, пригодного для электрофореза. Качество подготовки проб может сильно повлиять на качество данных результата. Солюбилизация белка - процесс, разрушающий взаимодействия в агрегации белков, такие как: дисульфидные связи, водородные связи, ван-дер-Ваальса, ионные и гидрофобные связи [4].

Для однозначного определения молекулярной массы белка по скорости его миграции при электрофорезе бывает целесообразно распрямить полипептидную цепочку белка и придать ей жесткость. Именно такой прием используется при электрофорезе белков, обработанных додецилсульфатом натрия. Для этого белки в исходном растворе препарата обрабатывают не менее чем трехкратным избытком ДДС-Na. За счет гидрофобных взаимодействий детергент примерно одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг ДДС-Na на 1 мг белка [2].

Основные фракции молочного белка приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Основные фракции белков молока [6, 7, 8, 9]

Белки	Изоэлектрическая точка	Молекулярная масса
α-Казейн	4.1	23,000
κ-Казейн	4.1	19,000
β-Казейн	4.5	24,000
γ-Казейн	5.8-6.0	-
α-Лакталбумин	5.1	14,437
β-Лактоглобулин	5.3	18,000
Лактоферрин	-	87,000

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили 3 вида сыра из смеси козьего и коровьего молока и 3 контрольных вида сыра, все с разным временем созревания:

S 1 – Сыр из смеси козьего и коровьего молока (21 сутки созревания),

S 2 – Сыр из смеси козьего и коровьего молока (14 суток созревания),

S 3 – Сыр из смеси козьего и коровьего молока (7 суток созревания),

S 4 – Сыр из коровьего молока – контроль (21 сутки созревания),

S 5 – Сыр из коровьего молока – контроль (14 суток созревания),

S 6 – Сыр из коровьего молока – контроль (7 суток созревания).

В 20 мг каждого образца добавили 200 µл ДДС-Na (10%), 100 µл ЕДТА (0,5 Н), натрия гидрооксида (0,85 Н), 700 µл дистиллированной воды и встряхивали в течение 1 часа при 70 0С. Затем центрифугировали при 4 0С со скоростью 14000 об/мин в течение 14 минут, после удалили супернатант. Для осаждения белка добавили 300 µл осаждающего раствора (трихлоруксусная кислота 50 г., дитиотреитол 200 мг., ацетон 50 мл.) и центрифугировали со скоростью 14000 об/мин в течение 14 минут при 7 0С. Промыли фильтрат 2 раза, 1 мл промывочным раствором (дитиотреитол 200 мг, ацетон 100 мл) и центрифугировали на обороте 14000 в течение 14 минут при 7 0С, постоянно выливая промывочный раствор. Окрашивание и приготовление геля проводили по протоколу Laemmli [10]. Электрофоретический анализ в присутствии 0,1% ДДС проводили в 10%, 12,5%, 15%, 17% и 20% полиакриламидном геле в шестикратной повторности. Использовались 2 маркера разных производителей:

• -    Thermo scientific (MTS) с белками молекулярной массой 200, 150, 120, 100, 85, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 кДа.

• -    Bio-Rad (MBR) с белками молекулярной массой 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15, 10, 5, 2 кДа.

Photoshop CS (AdobeSystems) использовали для регулировки яркости, настройки контрастности изображений геля (рис.1). TotalLab 100 был использован для анализа цифрового изображения 12,5% полиакриламидного геля.

Казеины

β – Лактоглобулин

α-Лакталбумин

Рисунок 2 - Анализ электрофореграммы сыров из коровьего молока с созреванием 7 суток

Рисунок 1 - Цифровое изображение окрашенного геля (12,5%) с нанесенными образцами белка и маркеры МTS и MBR.

Рисунок 3 - Анализ электрофореграммы сыров из смеси козьего и коровьего молока и контроль из коровьего молока контроль с созреванием 14 суток

смеси козьего и коровьего молока и контроль из

Рисунок 4 - Анализ электрофореграммы сыров из коровьего молока контроль с созреванием 21 суток

смеси козьего и коровьего молока и контроль из

Результаты и их обсуждение

Белки были определены согласно их молекулярной массе в сравнении с маркером. Обработка результата с помощью программного обеспечения Totallab Quant дает возможность определить точное положение белка на геле относительно маркеров. Анализ электрофореграммы сыров на 7 сутке созревания (рис. 2) показывает наибольшее количество основных фракций казеина в них (зона белков с молекулярным весом 22 – 24 кДа) и незначительное количество сывороточных белков (белки с молекулярным весом 18 – 14,5 кДа). Электрофореграммы сыров (анализируемый и контроль) на 14 и 21 сутке созревания (рис. 3 и 4) также не отличались. Количество искомых фракций казеина зависит от интенсивности окраски соответствующей полоски на геле и выражается в оптической плотности. С помощью образцов с известной концентрацией фракций белка можно составить градуировочную кривую и определить фракцию белка в сырах количественно.

Выводы

• 1.    Наилучшее разделение фракции белков национального мягкого сыра было на 12,5% полиакриламидном геле.

• 2.    При созревании в течении 21 суток при температуре 4 ⁰С, в национальных мягких сырах, изготовленных из коровьего и его смеси с козьим молоком, значительного изменения в составе фракции белка не происходит.