Исследование численности и ферментативной активности микроорганизмов-деструкторов органического вещества растительных остатков каштановых почв степных пастбищ Бурятии

Важным компонентом почвы является ее микрофлора. Хорошее качество почвы предполагает: значительный уровень биомассы микроорганизмов; большое видовое и функциональное разнообразие биоты; оптимальное соотношение продуцентов и сапрофитов, обеспечивающее воспроизводство гумуса; высокий уровень развития компенсационных механизмов (3). Но в настоящее время почвенный покров степных пастбищ подвергается интенсивно антропогенному воздействию, что в конечном итоге приводит к нарушению структуры и функционирования микробных сообществ и, как следствие, к нарушению равновесия естественного почвообразовательного процесса, ухудшению качеств почвенного покрова и другим отрицательным процессам.

Почвенные микроорганизмы являются также универсальными и очень чуткими индикаторами среды. С их помощью можно проводить не только качественную, но и количественную оценку происходящих в экосистемах процессов. Поэтому без глубоких микробиологических исследований почв диагностировать направленность эволюции почвенного плодородия и в целом оценить их состояние в настоящее время не представляется возможным.

Основной целью наших исследований было изучение численности и ферментативной активности микроорганизмов – деструкторов органического вещества растительных остатков каштановых почв степных пастбищ Бурятии.

Объект и методы исследования

Объекты исследования: каштановые почвы, расположенные под ковыльно-разнотравными фитоценозами степных пастбищ (далее в тексте они представлены как участки) на территории Иволгинского и Мухоршибирского районов Бурятии, на высоте 598-686 м над уровнем моря с координатами 51008/-51036/с.ш. и 107003-1070768/в.д.

Методы исследования. Учет численности различных эколого-физиологических групп микроорганизмов проводили методом предельных разведений на селективных средах с помощью таблицы Мак-Креди, составленной на основании методов вариационной статистики (7). Для выделения сапрофитов использовали жидкую среду РПА.

Целлюлозоразрушающие (ЦРБ) и белокраз-рушающие бактерии выращивали в жидкой среде Пфеннига с добавлением фильтровальной бумаги и 1,5% пептона соответственно (6).

Для учета численности грибов использовали жидкую среду Чапека (1).

Численность актиномицетов определяли на агаризованной крахмало-аммиачной среде (4).

Изучение морфологии микроорганизмов проводили с помощью микроскопа Axiostar plus Zeiss с увеличением в 1000 раз.

Для выявления амилазной активности использовали раствор Люголя. Протеазную активность определяли на среде МПБ с добавлением желатина. О наличии каталазной активности исследуемых культур судили по образованию пузырьков кислорода, наблюдаемых через 1-5 минут после внесения бактерий в каплю 3% перекиси водорода на предметном стекле (5).

Для количественной оценки протеазной активности использовали спектрофотометрический метод. В качестве белкового субстрата использовали 1% желатин (рН=7). За единицу протеазной активности принимали количество ферментов, образовавших 1 мкмоль/мл тирозина за 1 мин в условиях опыта.

Определение биологической активности почв проводилось полевым аппликационным методом закладки хлопчатобумажной ткани (2).

Результаты исследования

Проведенные исследования почвенных образцов исследуемых степных пастбищ по всему почвенному профилю показали их достаточно высокую обогащенность микроорганизмами (табл. 1). По степени обогащенности микроорганизмами, по Д.Г. Звягинцеву (1987), исследуемые почвы являются богатыми и очень богатыми.

Преобладающими по численности среди исследованных эколого-физиологических групп почвенных микроорганизмов были бактерии – сапрофиты и грибы. Численность их варьировала от 104 до 107 кл/ и 106-107 КОЕ/г соответственно.

Таблица 1

Численность микроорганизмов в почвенных образцах каштановых почв Бурятии

Горизонт	Сапрофиты, кл/г	Протеолитики, кл/г	ЦРБ, кл/г	Актиномицеты, КОЕ/г	Грибы, КОЕ/г
Участок 1
А1	106	104	102	105	107
B	106	104	102	105	105
BCa	105	103	10	105	104
BCCa	-	-	-	-	-
Участок 2
А1	107	104	102	105	107
В 1Са	107	103	102	105	106
В 2Са	104	103	10	104	105
ВС	-	-	-	-	-
CCa	-	-	-	-	-
Участок 3
А1	105	105	102	104	107
B	106	104	101	104	106
С	105	103	102	104	105
Участок 4
А1	108	104	103	103	106
AB	104	104	103	103	105
BCa	107	103	102	105	105
C1Ca	104	102	102	104	-
C2Ca	103	102	10	103	-
Участок 5
А1	108	104	103	104	106
Д’. „ _ iпогр	104	104	103	104	106
B	107	104	102	105	105
CCa	104	104	10	105	-
А"- „ „ iпогр	103	103	10	104	-

Примечание: (-) – не исследовано

Большую роль в деструкции органического вещества почвы играют такие группы гидролитических бактерий, как целлюлолитики и проте-олитики.

Целлюлоза является главной составляющей растительного организма, и ее синтез по своим масштабам превосходит синтез всех других органических соединений. Сохраняющиеся в почве и возвращающиеся в нее растительные остатки на 40–70 % состоят из целлюлозы. Это и обуславливает важную роль разлагающих ее микроорганизмов. В исследуемых почвенных образцах нами отмечено незначительное количество аэробных целлюлолитиков (102–103 кл/г).

Протеолитики как деструкторы белков играют огромную роль в природе, и прежде всего они являются основным строительным материалом всех живых организмов. Численность данной группы микроорганизмов в исследуемых почвенных образцах варьировала от 102 до 105 кл/г.

Относительно высокое содержание представленных выше групп микроорганизмов наблюдалось в верхних горизонтах (0–20 см) почвы, что обусловлено высоким содержанием в них С орг. (2,54 до 4, 94%). Вниз по профилю почвы их численность уменьшалась на 1-3 порядка.

Неотъемлемой составной частью почвенных микробиоценозов являются актиномицеты. Они обнаружены во всех генетических горизонтах исследуемых почв и занимают значительное место в микробном сообществе. Актиномицеты широко распространены в почвах аридных районов, так как они по сравнению с другими бактериями более устойчивы к высушиванию. Наличие экзоспор позволяет им сохранять жизнеспособность даже в условиях полного высушивания. В некоторых почвенных образцах (4 и 5 участков) в С карбонатном горизонте наблюдается даже увеличение их численности. Как отмечают некоторые авторы, карбонатные породы являются одним из характерных местообитаний актиномицетов (3).

Полученные результаты численности почвенных микроорганизмов являются лишь косвенным показателем проявляемой ими биогеохимической активности. Поэтому заслуживают особого внимания исследования чистых культур микроорганизмов и их ферментативной активности.

Выделено и описано 7 культур бактерий-сапрофитов, 17 актиномицетов и 5 протеолити-ков .

Выделенные культуры сапрофитов представлены в основном Грам+ кокковидными и палочковидными клетками и образуют округлые, чаще точечные колонии с гладкой (блестящей или матовой) поверхностью, плоским или выпуклым профилем, ровным или волнистым краем и не ярко выраженной пигментацией (чаще бесцветные, редко окрашены в бледнорозовый и бледно-оранжевый цвета).

Культуры актиномицетов представлены Грам+ фрагментированным мицелием толщиной от 0,4 до 1,0 мкм, также встречаются кокковидные и палочковидные клетки (1–4 мкм). Колонии актиномицетов преимущественно округлой формы (0,3–1,0 см), с бугристым, выпуклым или кратерообразным профилем, складчатой или шероховатой, чаще матовой поверхностью, ри-зоидным, волнистым или гладким краем, не прозрачны, имеют неодинаково окрашенный субстратный (бежевый, темно- и красно-коричневый, фиолетово-багровый, желто- и оранжевокоричневый, белый, бледно-желтый) и воздушный (мучнисто-белый, бежевый, бархатистый фиолетово-багровый, бледно-розовый, коричнево-красный) мицелии. Для воздушного мицелия большинства выделенных актиномицетов характерен мучнистый или бархатистый белый налет. Таксономический состав исследуемых почвенных актиномицетных комплексов в основном представлен одним родом Streptomyces.

Культуры протеолитиков представлены Грам+ палочковидными клетками с закругленными краями длиной от 2 до 5 мкм и шириной от 0,5 до 2 мкм, большинство клеток собраны в стопки и цепочки, но встречается и диффузное расположение. Протеолитики в основном представлены в виде бесцветных колоний округлой формы (0,15–0,4 см), с выпуклым и бугристым профилем, гладкой и бороздчатой блестящей и матовой поверхностью, ровным, лопастным и волнистым краем.

Все выделенные культуры микроорганизмов были проанализированы на наличие потенциальной амилазной, протеазной и каталазной активности.

Протеазной активностью обладают практически все выделенные культуры, за исключением двух культур бактерий-сапрофитов, и характеризуются широкой их вариабельностью. Количественные данные протеазной активности выделенных культур микроорганизмов представлены на рис. 1-3 и соответствуют 0,017– 0,336 ед. а.

Рис. 1. Протеазная активность культур сапрофитов

Рис. 2. Протеазная активность культур протеолитиков

Рис. 3. Протеазная активность культур актиномицетов

Амилазная активность отмечена у всех культур протеолитиков и большинства выделенных культур актиномицетов (88%) и сапрофитов (73). Менее выраженной амилазной активностью обладают протеолитики. Более выраженной амилазной активностью обладают 30% выделенных культур актиномицетов и 40% сапрофитов.

Каталазная активность отмечена практически у всех выделенных культур микроорганизмов и выражена в разной степени.

В полевых условиях аппликационным методом (путем закладки хлопчатобумажной ткани) проведено исследование биологической активности исследуемых почв. Показателем биологической активности почв явилось определение целлюлозоразрушающей их способности. В течение года подверглось разложению всего 25– 30% хлопчатобумажной ткани, в основном разложение модельного субстрата наблюдалась в верхнем горизонте (0–30 см) исследуемых почв. Видимо, это обусловлено незначительным содержанием и слабой активностью целлюлозоразрушающих бактерий, небольшой мощностью гумусового горизонта (не более 30 см) и почвенно-климатическими особенностями данного региона: длительным нахождением в мерзлом состоянии почв, глубоким промерзанием (распространением «вечномерзлотных» грунтов), слабой прогреваемостью и медленным оттаиванием нижних горизонтов почвенного профиля. Мощность толщи почв с отрицательными тем- пературами достигает 3–5 м и сохраняется в течение 160–180 дней (Убугунов, 2000).

Таким образом, рассмотренные экологотрофические группы микроорганизмов составляют основной сапротрофный блок, осуществляющий биогенную деструкцию органического вещества в исследуемых степных экосистемах. Высокая их численность и ферментативная активность дает возможность быстрее реагировать на изменения условий окружающей среды и принимать активное участие в разложении органических веществ. Однако природноклиматические особенности региона, небольшая мощность гумусового горизонта обусловливают низкую биологическую активность исследуемых почв.

• 2.    Гельцер Ю.Г. Биологическая диагностика почв. – М.: Изд-во Московского ун-та 1986.

• 3.    Добровольский Г.В., Чернов И.Ю. Роль почвы в формировании и сохранении биологического биоразнообразия. – М.: Товарищество научных изданий КМК, 2011. – 273 с.

• 4.    Практикум по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. – М.: Изд-во МГУ, 1976. – С. 106.

• 5.    Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; под ред. А.И. Не-трусова. – М.: Академия, 2005. – 608 с.

• 6.    Романенко В.И., Кузнецов С.Н. Экология микроорганизмов пресных водоемов. – Л.: Наука, 1974. – С. 30.

• 7.    Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверева Г.И. Практикум по микробиологии. – 5-е изд. – М.: Дрофа, 2004. – С.169-170.