Исследование гетерозиготности по антигенам групп крови в связи с гетерозисом животных

Статья С.П. Князева с соавт. «Свидетельствует ли повышенная частота гетерозигот по генам групп крови свиней о гетерозисе по жизнеспособности?» начинается с признания известного факта, что «гетерозиготность небезосновательно считают одной из причин гетерозиса». Авторам известно, «что в популяциях свиней выявлено статистически значимое превышение частоты гетерозигот по генам, детерминирующим группы крови...». Однако далее по всей статье это явление представлено как артефакт, обусловленный свойством, обязательно присущим используемым антисывороткам-реагентам. При этом авторы статьи допускают грубые методические ошибки и, стараясь экспериментально доказать свою гипотезу, приходят к несоответствующему действительности заключению об использовании ими для определения генотипов моноспецифических антисывороток, идентифицированных в Международных сравнительных испытаниях, полученных, якобы, в Институте цитологии и генетики (ИЦиГ) СО РАН. Однако это утверждение не соответствует фактам, так как при реорганизации лаборатории иммуногенетики и гибридизации животных эталонный банк реагентов был полностью оставлен в лаборатории экологической генетики и генофонда животных и проверенные сыворотки никому из авторов статьи не передавались. Выдвигаемая авторами гипотеза, что все обусловлено артефактами, как и всякая гипотеза, нуждается в научно обоснованном экспериментальном доказательстве, которое в статье совершенно отсутствует, как будет показано ниже.

Важное в теоретическом и практическом отношениях положение о связи гетерозиготности по некоторым локусам групп крови с пре- и постнатальной жизнеспособностью свиней было обнаружено нами более 40 лет тому назад (1, 2). Это было подтверждено большим числом экспериментов, которые нашли отражение в докторских диссертациях (3-9), а также многочисленными исследованиями авторитетных ученых: В.С. Кирпичников, Ю.П. Алтухов, А.М. Машуров и многие другие (1012). В рассматриваемой работе вместо доказательства своей гипотезы авторы делают амбициозное заявление, которое фактически дает отрицательный ответ на вопрос, поставленный в заголовке статьи, ссылаясь на то, что, по их мнению, вместо наблюдавшегося всеми эффекта повышенной частоты гетерозигот «...существует еще более простое объяснение, которое основывается ...» опять на гипотезе авторов, что положительный ответ обусловлен, якобы, использованием моноспецифических антисывороток, засоренных мифическими «паразитическими» антителами.

Разумеется, если при изучении гетерозиготности используют засоренную антисыворотку в качестве моноспецифического реагента для идентификации антигенов, может возникать ложный эффект гетерозиготности. Естественно, он обусловлен тем, что используется фактически не одна моноспецифическая антисыворотка, а несколько, содержащих больше чем одно антитело. Этот феномен наблюдается и используется при работе со специально полученными поливалентными антисыворотками, и он хорошо известен со времен замечательного открытия нашего соотечественника А.Я. Малаховского об эффективности гетерогенного подбора по биохимическому сходству (13). Тот факт, что спустя более 50 лет с этим явлением столкнулись авторы статьи, можно понять, но не понятно, зачем они сами сознательно использовали антисыворотки, заведомо засоренные. В статье, включая таблицу 1, нет данных о том, какие доноры и реципиенты были использованы при получении антисывороток и какие абсорберы были задействованы для доведения этих сывороток до моноспецифичности.

В попытке «более просто» объяснить все явления гетерозиготности, наблюдаемые при анализе частоты генотипов по генам групп крови, авторы выдвигают надуманную гипотезу, фактически ложное утверждение, о мнимой 100 % невозможности получения надежных моноспецифических антисывороток к антигенам систем групп крови. Однако такие сыворотки-реагенты реально существуют более полувека и их успешно применяют в работе многие известные научные авторитеты, начиная от Briles в США, чьи работы описаны мной ранее (2), и сотни иммуногенетиков во многих странах мира, включая выдающегося генетика в области свиноводства Ollivier (14).

Получением моноспецифических эталонных антисывороток лично мне довелось заниматься более 25 лет. В лаборатории иммуногенетики и гибридизации животных ИЦиГ СО АН мы, как и другие иммуногенетики, применяли достаточно надежную методику для диагностики теоретически возможной засоренности первоначально получаемой «сырой» антисыворотки. Именно таким образом и подбирают необходимых для дочистки таких сывороток животных (абсорберов), антигены крови которых способны «убрать» из «сырой» антисыворотки все лишние антитела. В дальнейшем специфичность сывороток обязательно проверяют не только в Международных сравнительных испытаниях, но и анализирующими иммуногенетическими тестами, включая беккроссы, о чем авторы либо не знают, либо сознательно умалчивают.

Не выдерживает критики псевдонаучная риторика авторов о том, что неудачная их попытка сегрегационного анализа связана с использованием гибридов филогенетически отдаленных пород. Генотипы рассматриваемых пород (крупная белая и светлогорская миниатюрная, полученная на основе свиней минисибс) хорошо известны, но грубые методические ошибки авторов обусловлены использованием непроверенных и неочищенных, заведомо «сырых», сывороток, а также недостоверным типированием подопытных животных.

Моноспецифические реагенты анти-Fa и анти-Lа были получены и воспроизведены нами во многих тождественных повторах посредством многих серий изоиммунизации в течение 40 лет. Последняя успешная проверка этих реагентов была проведена несколько лет назад на французских йоркширах. Однако авторы использовали не эти сыворотки, так как у европейских и американских пород свиней белой масти во всем мире антигены Fa и La очень редко встречаются (они привнесены в их генотипы от предков азиатского происхождения). У свиней крупной белой породы антигена Fa практически нет, а вот у авторов статьи в таблице 3 все 10 маток крупной белой породы вдруг, оказывается, имеют даже гомозиготный генотип Fa/Fa, а все другие 15 маток крупной белой породы приобрели очень редкий гомозиготный генотип La/La. Кстати сказать, в племенном хозяйстве, откуда отобрали маток для скрещивания, в стаде не было ни одного животного с такими генотипами, а частота аллелей F^а и L^a составляла соответственно 0,003 и 0,096. Естественно, что при таком подборе для анализирующего скрещивания ошибочно типированных, якобы, Fa- и La-позитивных животных, среди потомков оказалось неправдоподобно много позитивных животных — в 2 раза больше, чем негативных. И такую нелепость авторы с полным доверием анализируют биометрическими методами.

Для придания значимости работе с явно засоренными антисыворотками и заведомо неправильно типированными животными авторы сообщают, что ими была та-102

ким же образом проанализирована сегрегация аллелей у 519 потомков в 57 семьях (это составляет только 9 поросят на помет, что для маток крупной белой породы мало, но о генотипах остальных поросят не сообщается). Этот опыт, естественно, может свидетельствовать лишь о его научно-методической несостоятельности, так как необходимо соблюдать хорошо известные элементарные методические правила по обязательному использованию надежно проверенных чистых реагентов и тщательно подбирать и ти-пировать подопытных животных — родителей и потомков.

Для оценки адекватности гипотезы о том, что превышение частоты гетерозигот над частотой гомозигот определяется не гетерозиготностью, а неправильным ти-пированием неадекватными сыворотками, авторы предлагают использовать модель, которая отражает расхождения по реальной и «имитируемой» дивалентными антисыворотками частоте аллелей. Моделью, подобной той, которая представлена в таблице 2, действительно можно пользоваться в тех случаях, когда есть сомнения по моноспецифичности антисывороток. И подобную модель применяют все и всегда при создании моноантисывороток, с тем чтобы подобрать антиген-позитивных абсорберов. В контексте материалов статьи предлагаемая модель не нужна, так как засоренность использованных сывороток очевидна, а о характеристике «сорных» антител и тем более о том, какую часть гетерозигот можно было бы отнести за их счет, такая модель дополнительной информации не дает. Для подтверждения авторской гипотезы необходимо пользоваться проверенными моноспецифическими, а не заведомо загрязненными поливалентными антисыворотками.

Не менее важна правильная методическая организация любого опыта. Так, вызывает недоверие таблица 3, содержащая цифровые данные по пяти комбинациям скрещиваний: в первой строке таблицы приведена комбинация скрещивания маток крупной белой породы Fa/Fa с хряками Fa/Fb, но найти 10 маток с таким генотипом невозможно, потому что их фактически не существует в природе, что подтверждается анализом многих тысяч животных в работах различных авторов (3, 9, 15). Следует ли тратить время на иммуногенетический и биометрический анализы такого заведомо недостоверного материала в отношении подбора животных и их типирования? В пятой строке таблицы 3 приведены данные по анализирующему скрещиванию, которое, якобы, проводили для оценки сегрегации аллеля La ; эти показатели только подтверждают недостоверность при подборе животных-анализаторов и ошибочность их типирования. Свиньи крупной белой породы с аллелем La в природе большая редкость: по данным Сердюка, частота аллеля L^a составляет 0,057, a F^а — 0,016 ( n = 4217 гол.). Остальные анализирующие скрещивания, представленные в таблице 3, не уменьшают сомнений в достоверности выбора родительских форм и правильности их иммуногенетического типирования. Поэтому в научных исследованиях необходимо считаться с уже имеющимися научными достижениями, проверяемостью, повторяемостью и возможностью подтверждения тех или иных результатов.

При анализе скрещивания животных с генотипами Ga/a, Gb/b и Ga/b (см. вторую и третью строки таблицы 3) хотелось бы сопоставить результаты по 102 животным (8+2 помета) с данными наших исследований при аналогичных типах скрещивания маток и хряков крупной белой породы (племзавод «Никоновское», Московская обл.) (2, 16). При этом мы использовали методику идентификации моноспеци-фическими сыворотками, исключавшую возможность ошибочного типирования родителей и потомков. При скрещивании чистопородных родителей Ga/a было получено 24 помета с 258 поросятами Ga/a, то есть среднее многоплодие составляло 10,75±0,49 гол., доля слаборожденных — 9,30 %. Однако при скрещивании гомозиготных родителей Ga/a и Gb/b между собой было получено 73 помета с 854 гетерозиготными поросятами (Ga/b), то есть многоплодие возросло — 11,70±0,30 гол., а доля слаборожденных снизилась — 3,16 %. Эти данные о превосходстве пре- и постнатальной жизнеспособности гетерозиготных генотипов над гомозиготными, когда исключено сомнение в правильности иммуногенетического типирования генотипов, подтверждаются очень большим числом скрещиваний гетерозиготных родителей между собой (Ga/b х Ga/b): 114 пометов, включавших 1308 поросят, среднее много- плодие — 11,47 гол., доля слаборожденных — 3,16 %.

При этом была выявлена очень низкая доля рождаемости гомозиготных поросят с генотипом Ga/a — 11,56 % от всех родившихся. Таким образом, гетерозиготных животных оказалось при рождении на 29,4 % больше, чем гомозиготных, а число погибших в первые 2 мес постнатального периода составляло 99 гол. (10 %) против 237 гомозиготных животных (15,44 % от родившихся). Очень близкие результаты были получены при сравнительном изучении пре- и постнатальной жизнеспособности свиней ландрасской и других пород с гомо- и гетерозиготными генотипами (16). Поэтому полученные Князевым с соавт. очень ограниченные и в высшей степени сомнительные данные не могут служить доказательством несостоятельной «простой» гипотезы о засорении моноспецифических сывороток мифическими антителами и опровергать многочисленные экспериментальные исследования по селективным преимуществам гетерозигот, проводившиеся в разных странах в течение многих лет.

Главный же вопрос, рассматриваемый авторами как спорный, заключается в том, можно ли по данным иммуногенетического анализа судитъ о гетерозиготности определенных функциональных систем организма? История серьезного изучения этой проблемы началась в 50-х годах прошлого века. Достаточно упомянуть большую серию классических 10-летних работ по гетерозиготности птицы (17-19). По многолетним данным, гетерозиготные куры обладают повышенной жизнеспособностью в пре- и постнатальные периоды жизни (в шести линиях из семи), что подтверждается анализом эритроцитарных антигенов систем групп крови В и L. Аналогичные результаты получены по жизнеспособности и продуктивности гетерозиготных особей крупного рогатого скота (12, 20). Взаимосвязь между гетерозиготностью, жизнеспособностью и продуктивностью свиней выявлена посредством оценки систем групп крови D, Е, К, G и L (2). Эти данные убедительно и многократно подтверждены, обобщены и критически проанализированы в многочисленных исследованиях многих авторов (3, 5-9). Для краткости я опустил много очень важных публикаций авторитетнейших ученых, подтверждающих этот вывод. Крупнейший международный эксперт в области генетики и селекции животных профессор Ollivier подчеркивает, что жизнеспособность свиней вполне корректно оценивается по набору маркерных локусов и может быть использована в качестве показателя гетерозиготности всего генома (14).

К тому, что сказано о предлагаемой математической модели для проверки гипотезы о ди- и поливалентности, можно порекомендовать добавить очень много моделей на все случаи возможных причин ошибок, но начинать надо не с дивалентности и моноспецифичности, а с реальных методических ошибок. Тут место гипотезам, еще более просто объясняющим появление животных с неожиданными генотипами: выбор не тех родителей, которых не так случили, перепутали поросят из разных гнезд и т.д.

Итак, основные выводы нашего критического рассмотрения статьи С.П. Князева с соавт. «Свидетельствует ли повышенная частота гетерозигот по генам групп крови свиней о гетерозисе по жизнеспособности?» сводятся к следующему:

— Моноспецифические сыворотки, по чистоте пригодные для выявления антигенов групп крови и надежной оценки с необходимой достоверностью частоты гетерозиготности, успешно получают как во многих лабораториях мира, так и в нашей стране. Никакая псевдонаучная риторика не может заставить усомниться в этом факте. Это так же очевидно, как и необходимость проводить иммуногенетические исследования по гетерозиготности только пpoверенными и пригодными для анализа реагентами.

— Исследования, описанные в рассматриваемой статье, проводили заведомо неспецифическими реагентами. По недостоверному типированию видно, что эти сыворотки не имеют ничего общего с идентифицированными в Международных сравнительных испытаниях. Утверждение о том, что использованные реагенты получены и идентифицированы в ИЦиГ СО РАН, не соответствует действительности. Отсюда следует вывод о том, что авторы, вопреки их утверждению, пользовались «сырыми» сыворотками неизвестного происхождения.

— Проведенный авторами эксперимент по анализу сегрегации гомо- и гетерозиготных генотипов методически некорректен, во-первых, из-за использования явно загрязненных реагентов и, во-вторых, из-за подбора для анализирующего скрещивания заведомо ошибочно типированных по генотипам животных (например маток крупной белой породы, типированных как гомозиготных по генотипу Fa/a и La/a).

— Накопленные во многих странах мира (в том числе и нашей) за последние пять-шесть десятилетий многочисленные экспериментальные данные убедительно свидетельствуют о повышенной жизнеспособности и продуктивности свиней и животных других видов, гетерозиготных по некоторым локусам генома, по сравнению с гомозиготными особями.

— При сравнительном иммуногенетическом анализе большого числа чистопородных свиней крупной белой и других пород с гомо- и гетерозиготными генотипами при условии, когда использовали одни и те же идентифицированные моноспе-цифические сыворотки, получен однозначный положительный ответ на вопрос, заданный авторами статьи. При этом научно-методическая постановка опыта исключала возможность ошибочного определения генотипов, что и обусловило четкий результат, альтернативный продемонстрированному в обсуждаемой статье.

— Следует иметь в виду, что ошибки при иммуногенетической оценке гетерозиготности животных по частоте генотипов могут быть обусловлены не только явными методическими ошибками (как, например, в рассматриваемой статье), но также сложностью структуры локусов, детерминирующих гетерозиготные генотипы.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    Т и х о н о в В.Н. Исследование гетерозисной сочетаемости у свиней с помощью иммуноге-нетического анализа. В сб.: Методы разведения свиней. М., 1965.

• 2.  Т и х о н о в В.Н. Использование групп крови при селекции животных. М., 1967.

• 3.   П а в л и ч е н к о В.П. Изменчивость групп крови в популяциях свиней и ее связь с хозяйственно полезны

  ми признаками. Автореф. докт. дис. Л.—Пушкин, 1975.

• 4.    Б е з е н к о С.П. Генетико-популяционные характеристики свиней по группам крови. В сб.: Породы свиней. М., 1981: 133-148.

• 5.    Г о р и н В.Т., Н и к и т ч е н к о И.Н., Р о м а н о в Ю.Д. и др. Возможности прогнозирования селекционного процесса и гетерозисного эффекта в животноводстве. В сб.: Генетическая теория отбора, подбора и методов разведения животных. М., 1976: 85-97.

• 6.    Г и л ь м а н З.Д. Мясная продуктивностъ свиней плановых пород Белоруссии. Методы ее определения, прогнозирования и совершенствования. Автореф. докт. дис. Персиановка, 1974.

• 7.    С у х о в а Н.О., Б у р л а к З.К., Д м и т р и е в а Г.Л. Использование иммуногенетическо-го анализа в племенном свиноводстве. Новосибирск, 1981.

• 8.    Т о л п е к о Г.А. Формирование иммуногенетической структуры популяций свиней в связи с методами разведения и отбором по продуктивности. Автореф. докт. дис. Краснодар, 1985.

• 9.    С е р д ю к Г.Н. Иммуногенетические маркеры и их использование для повышения эффективности селекции свиней. Автореф. докт. дис. СПб–Пушкин, 2000.

• 10.  К и р п и ч н и к о в В.С. Генетика и селекция рыб. Л., 1987.

• 11.  А л т у х о в Ю.П. Генетические процессы в популяциях. М., 2003.

• 12.  М а ш у р о в A.M. Генетические маркеры в селекции животных. М., 1980.

• 13.  М а л а х о в с к и й А.Я. Проблема индивидуального подбора и методики установления различной

  сочетаемости родительских пар. Тр. Омского СХИ. Омск, 1960, 40: 3-17.

• 14.    O l l i v i e r L. Genetic improvement of the pig. In: The Genetics of the Pig. London, N.Y., 1998: 511-540.

• 15.  С е р д ю к Г.Н. Иммуногенетика свиней: теория и практика. СПб, 2002.

• 16.  T i k h o n o v V.N. Studies on blood group factors for genetical analysis of selection processes. In: Poli-

  morphismes Biochimiques des Animaux. Paris, 1966: 175-179.

• 17.    B r i l e s W., A l l e n C., M i l l e n T.W. The blood group system of chickens. I. Hеterozygosity in closed population. Genetics, 1957, 42: 631.

• 18.    B r i l e s W.E., B r i l e s R.W., I r w i n M.R. Differences in specificity of the antigenic products of a series of alleles in the chicken. Genetics, 1952, 37: 359-368.

• 19.    D e S i l v a R.L. Heterozygosity at red cell antigen locus L and fertility in chickens. Genetics, 1965, 51, 1: 41-58.

• 20.    M о g e n s P. Hetero blood types and breeding performance. Science, 1959, 129: 3351-3353.

Институт цитологии и генетики СО РАН ,