Изменения показателей крови и реакции регионарных лимфатических узлов при введении в дефекты большеберцовой кости препарата на основе этидроната лантаноида и кальция в эксперименте

По статистике ежегодно регистрируется большое количество травм, 20% из них связаны с переломами костей. Несмотря на успехи, достигнутые за последние годы в лечении травм, существует еще целый ряд нерешенных проблем. Это – увеличение числа и тяжести открытых и закрытых повреждений, а также частое развитие различных осложнений в процессе их лечения. По данным разных авторов, от 6 до 51,8% случаев переломов длинных костей осложняются несращением и развитием ложных суставов [2, 3]. Современным решением проблемы является применение при операциях по костной пластике совместно с металлическими имплантатами или, независимо от них, комплексных соединений, содержащие ряд минеральных компонентов, органических стимуляторов функции остеобластов [5, 8].

Цель исследования – выявить эффективность влияния препарата «Инрок», содержащего ионы лантаноидов и кальция на репаративную регенерацию кости в дырчатых дефектах метафиза.

Материалы и методы. Исследования выполнены согласно ГОСТ ИСО 10993 (Р) и одобрены Локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (протокол заседания №9 от 25 ноября 2014).Экспериментальной моделью явились 36 кроликов в возрасте 6 – 10 месяцев с массой тела 2500-2800 г. Животные были подобраны по принципу аналогов и разделены на 2 группы.

Всем экспериментальным животным в стерильных условиях под нейролептаналгезией (Rometar 2% 0,15 – 0,2 мл/кг, золетил 100 10 – 15 мг/кг) проводили моделирование несквозного дефекта в проксимальном отделе большеберцовой кости с медиальной поверхности [9]. Оперативный доступ к кости осуществляя через разрез кожи и подкожной клетчатки на 2 см ниже бедроберцового сочленения. Высверливали отверстие в одном кортикальном слое диаметром 3мм. Заключительный этап операции включал ушивание раны прерывисто-узловатыми швами. Животным в первой группе (группе сравнения) препарат в зону травмы не вводился; во второй группе (опытной) вводился препарат «Инрок» в дефект кортикальной пластинки на 3 и 5 сутки после операции в дозе 0,2 мл.

Для исследования были использованы серии препарата содержащие в составе активное вещество-этидроновую кислоту моногидрат, кальций хлорид дигидрат и вспомогательные вещества: гадолиния (III) нитрата гексагидрат, диспрозия (III) хлорида гексагидрат, воду для инъекций [7].

Взятие крови для определения биохимических показателей сыворотки крови осуществляли венепункцией v. Saphenalateralis: до операции, на 3-е, 7-е, 14е, 21-е и 56-е сутки после оперативного вмешательства. Применяли вакуумные пробирки IMPROVE с гелем-активатором свертывания крови. Для оценки ответа острой фазы определяли: уровень С-реактивного белка (СРБ) (с использованием полуколичественного теста на основе латекс-агглютинации «HUMAN», Германия). В сыворотке крови определяли маркеры костного метаболизма: общую активность щелочной фосфатазы (ЩФ) (кинетическим колометрическим методом с применением тест системы ALPDGKC (AuditDifgnostics, Ireland)), уровень кальция (Са) (фотометрическим методом (СРС, HUMAN)) и фосфора (Р) (спектрометрическим методом (HUMAN))[10].

При исследовании морфологического состава взятие крови осуществляли венепункцией v. Saphenalateralis: до операции, на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е, 28-е, 42-е и 49-е сутки после оперативного вмешательства. В крови определяли: скорость оседания эритроцитов (СОЭ), концентрацию гемоглобина, количество эритроцитов и лейкоцитов [6].

Морфологическое изучение подколенных лимфатических узлов интактной и оперированной конечностей (левой и правой соответственно) проведенона 56 сутки эксперимента. Изготовление гистологических препаратов подколенных лимфатических узлов (правой оперированной, левой интактной конечностей) проводили по общепринятой методике (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996; Romies В., 1954 ) : после фиксации в 10% нейтральном формалине, промывки и соответствующей проводки материала по спиртам возрастающей концентрации, выдержки в ксилоле и заливки в парафин [1].

На микротоме «LeicaSM 2000R» изготавливали гистологические срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином и пикрофуксином по ванГизону [4].

Изучение объектов проводилось с использованием микроскопа «Axioscop» фирмы «Цейс».

Полученные цифровые результаты обработаны с помощью пакетов прикладных программ SPSS v.13.0 c применением t-критерия Стьюдента с поправкой Bonferroni. Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследований.

Наблюдение и исследование общего клинического состояния подопытных животных не выявили изменений общего состояния и пищевой возбудимости у всех животных опытной группы и группы сравнения на протяжении всего эксперимента. Кролики достаточно хорошо переносили общее обезболивание и оперативное вмешательство. Двигательная активность восстанавливалась через 30-35 минут, пищевая возбудимость через 3-5 часов.

Результаты биохимических показателей сыворотки крови показали, что при определении СРБ как неспецифичного индикатора воспаления в организме, у животных группы сравнения и опытной группы достоверное снижение его концентрации наблюдалось в опытной группе на 3-е сутки после оперативного вмешательства. Далее динамика и характер изменений концентрации данного показателя были подобны в обеих группах (таб.1).

Таблица 1 - Динамика концентрации СРБ в сыворотке крови (мг/л)

Сроки эксперимента	Уровень показателей
	Группа сравнения	Опытная группа
До опыта	25,92±7,15	13,44±4,69
3 сутки	10,71±2,32*	6,17±0,92
7 сутки	4,73±0,65**	4,66±0,65
14 сутки	5,65±0,66*	5,82±1,09
21 сутки	6,72±2,49*	4,29±1,21
56 сутки	6,22±2,23*	5,68±1,03

* - достоверные различия с дооперационными значениями группы сравнения р<0,05 **р<0,01

Данные полученные при изучении показателей обмена костной ткани в динамике после частичного повреждения одного кортикального слоя большеберцовой кости в виде дырчатого дефекта, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Динамика концентрации щелочной фосфатазы, кальция, фосфорав сыворотке крови

Сроки эксперимен та	Уровень показателей
	ЩФ, Е/л		Кальций, ммоль/л		Фосфор, ммоль/л
	Группа сравнения	Опытная группа	Группа сравнения	Опытная группа	Группа сравнения	Опытная группа
До опыта	129,75±24,78	164,99±26,73	3,07±0,09	3,22±0,06	1,41±0,19	1,37 ±0,13
3 сутки	104,93±14,63	101,25±13,79	3,28±0,14	3,24±0,10	1,14±0,08	1,10 ±0,10
7 сутки	129,43±16,92	138,59±20,01	3,16±0,10	3,31±0,05	1,34±0,08	1,37 ±0,15
14 сутки	177,10±41,22	142,48 ±33,4	3,13±0,07	3,14±0,11	1,27 ±0,1	1,29 ±0,08
21 сутки	150,24±22,92	139,00±26,01	3,20 ±0,06	3,12 ±0,08	1,37±0,11	1,36±0,10
56 сутки	173,82±14,68	199,08±57,09	3,19±0,13	3,02 ±0,11	1,27±0,10	1,41±0,07

Показатель щелочной фосфатазы в обеих группах (опытной и группой сравнения) понижался на 3-е сутки и 21-е сутки, однако на протяжении всего опыта достоверного отличия между обеими группами не наблюдалось.

На 3-е сутки отмечалось повышение концентрации кальция в группе сравнения, а на 7-е сутки только в опытной группе. Восстановление концентрации произошло только в конце эксперимента на 56-е сутки. Достоверного отличия между группами не было отмечено.

Значительных колебаний в содержании фосфора в сыворотке крови кроликов обеих групп не отмечалось. На 3-е сутки после оперативного вмешательства отмечалось незначительное снижение концентрации фосфора в обеих группах, с последующим его повышением до исходного уровня к концу опыта.

При анализе морфологических показателей крови установлено, что скорость оседания эритроцитов (СОЭ) в опытной и группе сравнения повышался на 2, 7, 28 сутки после оперативного вмешательства (таб.3). Однако на протяжении всего опыта достоверного отличия между группами не наблюдалось.

Таблица 3. Динамика скорости оседания эритроцитов в крови (мм/ч)

Сроки эксперимента	Уровень показателей
	Группа сравнения	Опытная группа
До опыта	1,1±0,2	0,8±0,1
2 сутки	2,1±0,3	1,4±0,2
7 сутки	2,6±0,6*	1,5±0,3
14 сутки	1,1±0,2	1,2±0,2
21 сутки	1,1±0,2	0,9±0,1
28 сутки	1,8±0,3	1.8±0,5
42 сутки	1,1±0,1	1,3±0,2
49 сутки	1,2±0,2	1,2±0,2

* - достоверные различия с дооперационными значениями группы сравнения р<0,05

Достоверное            понижение      сутки эксперимента (р=0,023). Но данные концентрации гемоглобина наблюдалось в      значения этого показателя оставались в крови кроликов опытной группы по      пределах референтных значений (таб.4).

сравнению с группой сравнения на 2-е

Таблица 4. Динамика концентрации гемоглобина в крови (г/дл)

Сроки эксперимента	Уровень показателей
	Группа сравнения	Опытная группа
До опыта	14,0±0,7	12,7±0,6
2 сутки	12,3±0,2*	13,2±0,3
7 сутки	13,1±0,4	12,1±0,5
14 сутки	13,2±0,4	13,0±1,0
21 сутки	13,7±0,3	14.3±0,4
28 сутки	11,9±1,0	13,2±0,5
42 сутки	12±1,3	12,9±1,8
49 сутки	12,4±1,3	12,5±1,2

* - достоверные различия значений опытной и группой сравнения р<0,05

Наблюдался лейкоцитоз в обеих показателя в опытной группе по сравнению группах на всем протяжении эксперимента. с группой сравнения (р=0,042). Данное На 14-е сутки эксперимента отмечалось увеличение находилось в пределах нормы достоверное увеличение данного (таб.5).

Таблица 5. Динамика содержания лейкоцитов в крови (х109/л)

Сроки эксперимента	Уровень показателей
	Группа сравнения	Опытная группа
До опыта	4,6±0,52	5,17±0,24
2 сутки	5,56±0,4	6,03±0,75
7 сутки	5,53±0,53	5,79±0,69
14 сутки	4,59±0,26*	5,59±0,36
21 сутки	6,74±0,84	6,8±0,61
28 сутки	4,6±0,59	5,72±0,21
42 сутки	6,62±0,41	6,8±0,72
49 сутки	5,89±0,8	6,64±0,63

* - достоверные различия значений опытной и группой сравнения р<0,05

Характер и динамика изменений количества эритроцитов в крови кроликов в группе сравнения и опытной группах были подобны. На 49-е сутки определено достоверное повышение количества эритроцитов в группесравнения (р=0,027) по сравнению с опытной группой, оставаясь при этом в пределах физиологической нормы (таб.6).

Таблица 6. Динамика содержания эритроцитов в крови (х1012/л)

Сроки эксперимента	Уровень показателей
	Группа сравнения	Опытная группа
До опыта	5,01±0,31	4.61±0,34
2 сутки	4.34±0,19	4.96±0,27
7 сутки	4.62±0,31	5,10±0,56
14 сутки	5,04±0,26	4.29±0,34
21 сутки	4,91±0,39	4,82±0,33
28 сутки	4,15±0,38	4,96±0,27
42 сутки	5,52±0,57	5,13±0,17
49 сутки	4,52±0,21*	5,12±0,12

* - достоверные различия значений опытной и группой сравнения р<0,05

В конце эксперимента было проведено исследование региональных лимфатических узлов обеих тазовых конечностей. При гистологическом исследовании, проведенном через 56 суток, у животных опытной и группы сравнения левого лимфатического узла интактной конечности определилось, что изменения были идентичны. Структура соответствовала норме, т.е. так лимфатическому узлу» (рис. 1).

Структура лимфоузла оперированной конечности у животныхобеих исследуемых групп, незначительно отличалась от лимфатического узла интактной конечности. Отличительной особенностью лимфатического узла данного региона явилось наличие участков склеролипоматозной трансформации ткани лимфоузла (рис.2) и склероза синусов.

называемому

«нестимулированному

Рис. 1 - Нормальная гистологическая структура «нестимулированного» левого подколенного лимфатического узла интактной конечности. Группа сравнения, 56 сутки. Окраска гематоксилином и эозином.об.10,ок.20.

Рис. 2 - Правый подколенный лимфатический узел оперированной конечности: склеролипоматозная трансформация. Группа сравнения, 56 сутки. Окраска гематоксилином и эозином. об.10,ок.20.

Обсуждение. Таким образом, обобщая результаты исследований биохимического состава сыворотки крови подопытных кроликов можно заключить, что претерпевали значительные изменения следующие показатели: С-реактивный белок имел тенденцию к повышению; кальций, щелочная фосфатаза, имеющие в начале тенденцию к снижению. Значительным сдвигам не подвергался такой показатель как фосфор, ввиду малой травматизации.

Анализируя результаты полученных гематологических исследований можно сделать вывод, что значения СОЭ, концентрация гемоглобина, количественные показатели лейкоцитов, эритроцитов в обеих опытной и группой сравнения изменялись идентично.

Заключение . Данные колебания в вышеуказанных показателях количества эритроцитов и лейкоцитов в крови, а также биохимического состава сыворотки крови существенно колебалось в первую половину эксперимента (2-21 сутки), видимо в связи с острой фазой воспалительного процесса в костной и параоссальных тканях, и нормализовались к концу опыта. Учитывая, что данные сдвиги не выходили за пределы физиологической нормы, можно предположить об отсутствии реакции основных показателей системы крови на введение препарата «Инрок» в смоделированный костный дефект. То есть при локальном введении препарата на основе ионов лантаноида и кальция не возникает негативной реакции организма экспериментальных животных. Следовательно, данный препарат имеет достаточно высокую степень биосовместимости.

Практически идентичные изменения регионарных лимфатических узлов на поздних сроках эксперимента в группах сравнения и опыта, также свидетельствует об отсутствии неблагоприятного воздействия на них данного препарата.

Резюме

В данной статье представлено исследование о действия препаратов на основе этидроната лантаноидов и кальция при заживлении дырчатого отверстия большеберцовой кости у экспериментальных животных. Исследуемый препаратв своем составе содержат активное вещество - этидроновую кислоту моногидрат, кальций хлорид дигидрат и вспомогательные вещества - гадолиний и диспрозий, воздействие которых было исследовано в эксперименте на лабораторных животных путем введения в костный дефект. Повреждение костной ткани и введение препарата, содержащего ионы лантаноидов и кальция в указанной дозе не вызывают изменений в морфологических и биохимических показателей состава крови и реакцию со стороны лимфатических узлов.