Изучение антигенной структуры вируса лейкоз крупного рогатого скота

Основным сдерживающим фактором при разработке иммунохимических методов диагностики инфекционных болезней является качество используемого антигена. Существующие в настоящее время методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота не учитывают генетическое многообразие возбудителя болезни. Результаты научных исследований последних лет свидетельствуют о необходимости комплексного подхода при определении, как антигенов вируса, так и антител к ним в серологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота. В статье описываются способ получения и изучения антигенных свойства белковых фракций ВЛКРС, выделенных из сыворотки крови инфицированных и больных лейкозом коров. На разработанный способ получен патент РФ на изобретение (№ 2564007) [3].

Материалы и методы. Сыворотки крови коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств РТ; набор для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотке крови и молоке методом ИФА производства ФГУП «Курская биофабрика»; циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) выделяли методом преципитации в полиэтиленгликоле (ПЭГ); иммуноферментный анализ ставили в непрямом твердофазном варианте; диск-электрофорез антигенов проводили по методу Laemmli (1970) [7] в пластинчатом полиакриламидном геле с использованием детергента додецилсульфата натрия и восстановителя разрыва по S-S связям - β мекркаптоэтанола; электроперенос белков фракционированных в ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану проводили по методике, описанной Towbin et al. (1989) [9].

Результаты и обсуждение. При выделении антигена ВЛКРС из сывороток крови больных лейкозом коров исходили из того, что вирусные частицы главным образом содержатся в составе ЦИК [1,8,10]. Технологию разрабатывали с учетом необходимости диссоциации ЦИК и избавления от сывороточных антител и всех остальных белков.

Получение антигена ВЛКРС из сывороток крови. Условно можно выделить 3 основные стадии:

• 1.    Выделение ЦИК. Сыворотку крови

  от больных лейкозом коров в объеме не менее 500мл смешивают раствором ПЭГ-6000 в 0,1М боратном буфере (рН-8,8) до 3% конечной концентрации. Перемешивают и оставляют на 24 часа при +4 °C, п о истечении этого времени центрифугируют 10 мин при 3000 об./мин. Супернатант сливают, а осадок растворяют в 5-ти кратном объеме 3% раствора ПЭГ-6000 в боратном буфере и вновь центрифугируют в тех же условиях (промывка).

• 2.    Диссоциация ЦИК и удаление глобулинов. Полученный осадок, содержащий ЦИК с компонентами вируса, растворяют в 3-х кратном объеме дистиллированной воды и выдерживают, периодически перемешивая, 1 час при 60⁰С. По истечении этого времени пробу смешивают равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония, осторожно перемешивают в течение 2-3 минуты и центрифугируют.

• 3.    Выделение и очищение антигенного препарата. Надосадочную жидкость осторожно отделяют и диализируют при комнатной температуре в течение 48 часов против дистиллированной воды. Фильтруют через бумажный фильтр и концентрируют (не менее в 10 раз) против силикагеля L 100/250 для хроматографии.

Изучали электрофоретическую подвижность полученных антигенных фракций в 12,5% полиакриламидном геле, а также проводили иммуноблот анализ полученных фракций с сывороткой крови инфицированных и больных лейкозом коров.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемый антиген является комплексным, содержащим различные белковые фракции вируса лейкоза. Как видно из электрофореграммы молекулярные массы фракций составляет от 14 до 160 и более кД. В зависимости от стадии инфекционного процесса против каждой из них образуются антитела (рис.2 и рис.3). Следовательно, из-за того, что спектр свободно циркулирующих в крови антител меняется с развитием инфекционного процесса, полученный антиген позволит более полное обнаружение антител к возбудителю и способствует повышению эффективности диагностических мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота.

Рис.1 – Электрофореграмма белковых компонентов ВЛКРС окрашенных азотнокислым серебром

Проводили иммуноблот анализ полученных фракций антигенов ВЛКРС с сывороткой кров инфицированных и больных лейкозом коров.

14  24 31    45    51     60   97

Рис.2 – Иммуноблотинг белковых компонентов ВЛКРС с сывороткой крови от

гематологически больной лейкозом коровы.

А

В

Б                             Г

Рис.3 - Денситограммы иммунноблотаграмм сероактивных полипептидов ВЛКРС с сыворотками крови от инфицированных коров на разной стадии развития инфекции.

Обозначения:

А – сыворотка крови коровы в начальной степени инфекции, впервые реагировавшей на РИД положительно;

Б, В - сыворотка крови коров, больных лейкозом на более поздних сроках болезни;

Г – сыворотка крови гематологически больной коровы;

№331

p6S p55

Антигенные свойства выделенных белковых фракций вирусных частиц изучали в ИФА с использованием сывороток крови инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров

Заключение. В сыворотке крови, в циркулирующих иммунных комплексах инфицированных ВЛКРС коров присутствуют различные белковые фракции вирионов [2,5,6]. Разработанный способ позволяет их экстрагировать и использовать в качестве антигена в иммунохимических реакциях для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Выделенный антиген по специфичности не уступает антигену gp51 применяемому в коммерческих наборах для ИФА, а по чувствительности даже превосходит.

Полученный антиген является комплексным, содержащим различные белковые фракции вируса лейкоза. Следовательно, из-за того, что спектр свободно циркулирующих в крови антител меняется с развитием инфекционного процесса, полученный антиген поспособствует более полному обнаружению антител к возбудителю и повышению эффективности диагностических мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота.

Следует отметить, что наиболее перспективным, в исключении недостатков существующих методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, может являться применение методов иммуноблот анализа [4].

J.Brenner,         R.Paz,         Z.Trainin//

Vet.Immunol.Immunopathol. 1992 Oct: 34 (12): 173-9; 5.