Изучение ассоциаций полиморфизма гена KCNB1 с молочной продуктивностью и качеством молока при включении в рацион дрожжевой добавки «КЛЮВЕР ПРО»

У коров с высоким уровнем молочной продуктивности в различные периоды физиологического состояния нередко наблюдаются нарушения энергетического обмена. Эти расстройства обусловлены как несоответствием энергетической ценности рациона физиологическим потребностям животных, так и снижением потребления корма на фоне повышенной потребности в энергии для лактогенеза [1]. Возникающий дефицит энергии компенсируется за счёт мобилизации внутренних резервов организма, что провоцирует развитие патологий обмена веществ, таких как кетоз, остеодистрофия, ацидоз, стеатоз печени и др. [2].

Животные с высоким генетическим потенциалом продуктивности особенно подвержены риску развития подобных нарушений, поскольку их физиология направлена преимущественно на синтез молока, даже при нехватке питательных веществ. Это обусловлено тем, что многолетний отбор по признаку удоя привёл к формированию лактационной доминанты, при которой организм направляет значительную долю ресурсов на продукцию молока, часто в ущерб другим системам [1].

Вдобавок, высокоуровневая продуктивность поддерживается посредством включения в рацион легкоусвояемых углеводистых кормов, что доказано ассоциируется с негативным воздействием на метаболические процессы в рубце жвачных. Исследования показывают, что при интенсивном потреблении крахмала увеличивается популяция амилолитических бактерий в рубце, что, в результате их жизнедеятельности, приводит к образованию значительного количества молочной кислоты, вызывающей снижение pH до значений ниже 6,0, тогда как для нормального функционирования руминальной микрофлоры необходим диапазон pH 6,5-7,2 [3]. В результате угнетается активность целлюлозолитических бактерий, перерабатывающих структурные углеводы, что приводит к снижению эффективности ферментативного расщепления корма. Угнетение нормофлоры рубца повышает вероятность развития нарушений обмена веществ и алиментарных заболеваний, что ведет, в том числе, к снижению репродуктивных показателей и, в конечном итоге, ограничивает продолжительность хозяйственного использования коров до 2-3 лактаций [2].

Рационы кормления должны быть выстроены таким образом, чтобы полностью обеспечивать физиологические потребности коров, особенно в переходный период и начале лактации. В этой связи особенно актуальными становятся исследования, направленные на разработку и внедрение инновационных стратегий профилактики, способствующих стабилизации микробиологического сообщества рубца и поддержанию оптимального уровня pH его среды. Одним из перспективных направлений для решения этой проблемы является включение в рацион дрожжевых пробиотиков, обладающих способностью поглощать кислород, тем самым формируя благоприятную анаэробную среду для жизнедеятельности облигатных микробов рубца [4, 5, 6]. Активация популяции целлюлозолитических и лактат-утилизирующих микроорганизмов способствует, в свою очередь, эффективному расщеплению клетчатки, повышению биодоступности компонентов корма и улучшению усвоения питательных веществ [7, 8].

Наряду с этим, установлено, что генетические факторы играют немаловажную роль в устойчивом закреплении продуктивных признаков у крупного рогатого скота, что определяет уровень потребления ими питательных веществ [9]. В странах с развитой системой животноводства, наряду с внедрением сбалансированной и научно-обоснованной системы кормления наблюдается уклон на молекулярно-генетическую селекцию по генетическим маркерам [10].

Работа ионных каналов и межмембранный транспорт регулируют формирование компонентов молока, которые синтезируются либо в клетках эпителия молочной железы, либо поступают туда из крови, проходя через апикальную мембрану. Для большинства таких соединений требуются специализированные транспортные белки - пассивные или активные [11].

Локусы генов, кодирующих трансмембранные белки, зачастую ассоциированы с признаками молочной продуктивности. Особый интерес представляют калиевые каналы, кодируемые семейством генов KCN , играющие важную роль в поддержании мембранного потенциала и межклеточной сигнализации. В частности, ген KCNB1 , относящийся к подсемейству потенциалзависимых калиевых каналов, вовлечён в процессы апоптоза, клеточной пролиферации и регенерации тканей молочной железы. Ген локализован на 13-й хромосоме крупного рогатого скота (BTA-13), имеет длину около 110,35 кб, включает два экзона и один интрон, и кодирует белок из 858 аминокислотных остатков. В интронной области данного гена был идентифицирован однонуклеотидный полиморфизм (g.78216220G>A). Ген KCNB1 рекомендован в качестве маркерного гена, ассоциированного с продуктивными признаками молочного скота [11, 12].

Целью исследования являлось изучить взаимосвязь полиморфизма гена KCNB1 (g.78216220G>A) с молочной продуктивностью коров голштинской породы при скармливании пробиотической добавки «КЛЮВЕР ПРО» на основе штамма дрожжей Kluyveromyces marxianus.

Условия, материалы и методы. В условиях СХПК племенного завода им. Ленина Атнинского района Республики Татарстан отобрали 120 клинически здоровых голов из дойного поголовья коров голштинской породы, сформировали две группы-аналогов по 60 голов в каждой. Опытной группе дополнительно скармливали по 20 г на голову в сутки «КЛЮВЕР ПРО» – пробиотическую дрожжевую добавку – в смеси с монокормом в течение 60 дней.

Осуществлялось индивидуальное контрольное доение дважды в сутки ежемесячно. В лаборатории селекционного контроля качества молока АО «ГПП «Элита» биохимический анализ молока проводился системой CombiFoss™7.

Для генетического анализа отбирались пробы крови у всех объектов исследования. Термические условия амплификации фрагментов ДНК представляли собой: начальная денатурация при 94°С 3 мин, 34 цикла по 1 мин при 94°С, последующий отжиг при 62,2°С 1 мин, элонгация при 72°С 1 мин и заключительная элонгация при 72°С 7 мин [11].

Использовался следующий комплект однонуклеотидных праймеров (Евроген, Россия):

• 5’ -TTCAAATCCCGACTCCACCA-3’;

• 5’- TAACACACAAAAGTCGCCCC-3’.

Затем проводилась полимеразная цепная реакция (ПЦР) из 2 мкл ДНК-образца с компонентами ПЦР-смеси: смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (СибЭнзим, Россия), праймеры (Евроген, Россия), Taq-полимераза, буферный раствор Taq-полимеразы, вода деминерализованная общим объемом 20 мкл. При t +37°С в течение 16 ч ферментом Msp I (СибЭнзим, Россия) выполняли рестрикцию полученных в ходе реакции продуктов.

Локус SNP- Msp I (g.78216220G>A) располагался с нуклеотидной заменой G на A в интроне 1. После этапа рестрикции сформировались фрагменты длиной 225 и 280 п.н. у генотипа KCNBIGG , 505, 225 и 280 п.н. для генотипа KCNB1GA и 505 п.н. для генотипа KCNB1AA соответственно.

Результаты и обсуждение. В результате проведенного исследования установлено, что из всего анализируемого поголовья 33 головы (27,50%) являлись носителями гомозиготного генотипа KCNB1АА , 52 головы (43,33%) – гетерозиготного генотипа KCNB1GА и 35 (29,17%) – гомозиготного генотипа KCNB1GG . Частота встречаемости аллеля KCNB1G – 0,51, KCNB1A - 0,49.

Суточный удой и качественный состав молока происследованного поголовья в разрезе полиморфизма гена KCNB1 представлены в таблице.

Таблица - Продуктивные качества молока исследуемых коров в разрезе полиморфизма гена KCNB1

		Генотипы KCNB1	Суточный удой, кг	Массовая доля жира, %	Выход молочного жира, г	Массовая доля белка, %	Выход молочного белка, г	Сумма выхода жира и белка, г
& К К & то И н к О	о о й к й к	AA (n=18)	25,52 ± 2,78	3,78 ± 0,32	958,73 ± 23,98	3,55 ± 0,28	900,77 ± 27,60	1859,50 ± 51,58
		GA (n=25)	26,39 ± 2,21	3,72 ± 0,24	978,17 ± 19,12	3,54 ± 0,23	930,82 ± 17,78	1908,99 ± 36,90
		GG (n=17)	26,93 ± 3,04	3,67 ± 0,34	981,44 ± 20,88	3,58 ± 0,29	958,22 ± 31,15	1939,66 ± 52,03
	й о п о W й к	AA (n=18)	25,89 ± 2,72	4,02 ± 0,29	1035,52± 34,56*	3,62 ± 0,25	932,68 ± 33,97	1968,20 ± 68,53
		GA (n=25)	27,10 ± 1,98	3,88 ± 0,18	1049,11 ± 28,12	3,61 ± 0,19	975,80 ± 20,11	2024,91 ± 48,23
		GG (n=17)	28,45 ± 2,86	3,74 ± 0,25	1059,26 ± 36,08	3,67 ± 0,29	1038,59 ± 22,96**	2097,85 ± 59,04
й к к & те то ^ о &	й о о й к й к	AA (n=15)	24,98 ± 2,17	3,81 ± 0,23	948,40 ± 25,39	3,55 ± 0,18	884,19 ± 32,15	1832,59 ± 57,54
		GA (n=27)	26,54 ± 2,14	3,70 ± 0,21	978,98 ± 23,59	3,52 ± 0,20	931,35 ± 22,38	1910,33 ± 45,97
		GG (n=18)	27,16 ± 2,63	3,62 ± 0,25	978,81 ± 27,57	3,60 ± 0,19	974,43 ± 43,17	1953,24 ± 70,74
	й о п о W й к	AA (n=15)	24,21 ± 2,46	3,84 ± 0,24	925,73 ± 36,52	3,49 ± 0,16	842,31 ± 47,17	1768,04 ± 83,69
		GA (n=27)	26,43 ± 2,12	3,66 ± 0,19	964,65 ± 27,47	3,53 ± 0,18	930,44 ± 27,35	1895,09 ± 54,82
		GG (n=18)	26,85 ± 2,93	3,64 ± 0,29	971,68 ± 29,20	3,58 ± 0,27	955,96 ± 32,72	1927,64 ± 61,92

Примечание: * -p<0,05; ** -p<0,05

Характер изменений среднесуточного удоя и качественного состава молока в обеих группах учитывали по сравнению с данными, полученными в начале опытного периода. Так, в группе дойных животных с генотипом KCNB1АА повысились показатели среднесуточного удоя на 0,37 кг (1,45%), массовой доли жира (МДЖ, %) на 0,24%, выхода молочного жира (ВМЖ, г) на 76,79 г (8,01%) и суммы выхода молочного жира и белка на 108,70 г (5,85%), в то время как в контроле в разрезе этого же генотипа снижение среднесуточного удоя составило 0,77 кг (3,08%), ВМЖ – 22,67 г

(2,39%), выхода молочного белка (ВМБ, г) – 41,88 г (4,74%), а суммы выхода белка и жира – 64,55 г (3,52%).

Среди лактирующих коров опытного поголовья с гетерозиготным генотипом в том же сравнении улучшились значения суточного удоя 0,71 кг (2,69%), МДЖ на 0,16%, ВМЖ на 70,94 г (7,25%), ВМБ на 44,98 г (4,83%) и суммарного значения количества жира и белка на 115,92 г (6,07%). При этом же сравнении у контрольного поголовья показатели существенно не изменились.

В опытной группе гомозиготным генотипом KCNB1GG по сравнению с данными, полученными в начале исследования, выявлено повышение среднесуточного удоя, которое составило 1,52 кг (5,64%), ВМЖ -77,82 г (7,93%), ВМБ - 80,37 г (8,39%), суммы выхода жира и белка - 158,19 г (8,16%). В контрольной же группе отмечено незначительное снижение по всем показателям.

Существенные различия замечены в опытной и контрольной группах при их сравнительном анализе между собой в полученных итоговых результатах. Среди группы коров с гомозиготным генотипом KCNB1АА в опытном поголовье отмечено повышение показателей среднесуточного удоя по сравнению с контрольным поголовьем на 1,68 кг (6,94%), ВМБ г на 90,37 г (10,73%), суммы выхода молочного жира и белка на 200,16 г (11,32%). Установлено достоверное повышение ВМЖ на 109,79 г (11,86%; p<0,05).

Отличались и продуктивные качества между поголовьем коров с гомозиготным генотипом KCNB1GG : опытная группа превосходила контрольную по удою на 1,60 кг (5,96 %), ВМЖ на 87,58 г (9,01 %), сумме выхода молочного жира и белка на 170,21 г

(8,83%). Отмечено достоверное повышение ВМБ на 82,63 г (8,64%; p<0,05).

Схожую динамику по среднесуточному удою за контрольный день наблюдали Kumari Ragini et al. [12] при исследовании индийского скота породы Сахивал – KCNB1GG (9,81±0,91) показал значимо (p≤0,05) более высокие значения по сравнению с генотипами KCNB1АА (7,46±0,66) и KCNB1AG (7,55±0,75).

Выводы. Данное исследование является первым, оценивающим влияние полиморфизма гена KCNB1 на продуктивные качества коров голштинской породы. В ходе опыта заключили, что по сравнению с контрольным поголовьем группа коров с генотипом KCNB1АА выгодно отличалась по показателям удоя в сутки в среднем на 6,94%, ВМБ на 10,73%, сумме количества жира и белка на 11,32%, в том числе отмечено достоверное повышение ВМЖ на 11,86% (p≤0,05). При том же сравнении поголовье с генотипом KCNB1GG превосходило контрольное по среднесуточному удою на 5,96%, ВМЖ на 9,01%, сумме количества жира и белка на 8,83%, и достоверно превосходило по ВМБ на 8,64% (p<0,05).