KI-67и сурвивин (Birc5) как биомаркеры прогрессии и рецидивирования мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря

Mirzakhanov Ramil Irecovich – postgraduate student; ORCID:

По последним литературным данным, мышечно-неинвазивная форма уротелиального рака характеризуется очень большой мутационной нагрузкой по частоте сравнимой с частотой при меланоме [1]. Современные лечебно-диагностические алгоритмы в различных направлениях онкологии все больше и глубже сопряжены с пониманием молекулярногенетического профиля опухолевой ткани. Только генетически-детерминированная персонификация позволяет значительно повышать качество проводимого лечения.

Большая часть первичных опухолей мочевого пузыря обладают низкой степенью злокачественности, ограничены слизистой оболочкой и часто рецидивируют после трансуретральных резекций. Однако до 30% мышечно-неинвазивных видов рака мочевого пузыря (МНИРМП) демонстрирует прогрессию заболевания до инвазивной стадии или переход в более высокую степень морфологической злокачественности [2].

Хорошо известные факторы риска рецидива РМП включают количество и размер опухолевых поражений, наличие сопутствующей карциномы in situ (CIS), количество рецидивов, стадию T в соответствии с классификацией TNM, гистопатологическую степень опухоли, пол и возраст. [3] На основе выбранных факторов риска были разработаны прогностические таблицы для определения риска повторного развития НМИРМП; однако, как показали более поздние анализы, они переоценивают риск рецидива у некоторых групп пациентов. Добавление новых элементов в существующие факторы риска рецидивирования может повысить точность и, в то же время, увеличить возможности использования прогностических моделей.

По данным зарубежной литературы, отмечена корреляция между экспрессией Ki-67 и стадией РМП, а также со степенью злокачественности опухоли. Ряд авторов показали, что наличие высокой экспрессии Ki-67 коррелирует с плохим прогнозом [4,5].

Также многие зарубежные исследователи показали, что химиорезистентность РМП индуцируется сверхэкспрессией набора генов, связанных с ингибированием апоптоза [6]. Среди этих генов сурвивин привлекает большое внимание как один из наиболее актуальных. Это ингибитор белка апоптоза (IAP), участвующего во многих клеточных реакциях на стресс, представленный в различных субклеточных компартментах. Сурвивин почти не обнаруживается в здоровых взрослых клетках, в то время как гиперэкспрессируется в фетальной и опухолевой ткани [7,8]. Четко доказана его связь с развитием самых разных видов рака, таких как карциномы толстой кишки, рак молочной железы, ретинобластомы, саркомы и лейкемии [7, 9,10,11].

В соответствии с вышеизложенным, целью нашего исследования является подтверждение прогностической ценности Ki-67 и сурвивина (BIRC5) в рецидивировании и агрессивности мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря в исследуемых группах.

Материалы и методы исследования.

В исследование вошло 234 пациента, получавших специализированное лечение на базе ФГБУ РНЦРР с 2017 по 2020 годы. Пациенты были разделены на три группы, группа первичных пациентов (n=83) с первичным мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря, пациенты после специализированного лечения мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря (n=81) и пациенты без уротелиального рак (МКБ, ДГПЖ, рак иной локализации). (n=70).

Лечение первой исследовательской группы пациентов было выполнено согласно клиническим протоколам РНЦРР МЗ РФ, подразумевающим забор биопсии из опухоли и неизмененной ткани мочевого пузыря с использованием эндоскопической фотодинамической диагностики с одновременной трансуретральной резекцией (ТУР) стенки мочевого пузыря с опухолью, а также проведение внутрипузырной химиотерапии препаратами доксорубицин или митомицин, далее контрольные цистоскопии выполнялись каждые три месяца в течение года.

У всех пациентов произведено определение уровня экспрессии мРНК генов методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). [14]

В последующем произведен сравнительный анализ транскрипции генов:

• 1.    В ткани опухоли в зависимости от клинико-морфологических характеристик заболевания, результатов лечения.

• 2.    В морфологически-неизмененной ткани мочевого пузыря у пациентов с МНИРМП.

• 3.    В ткани мочевого пузыря у пациентов с пролеченным МНИРМП, находящихся под динамическим наблюдением.

• 4.    В ткани мочевого пузыря у пациентов с гиперплазией предстательной железы, аденомой предстательной железы, раком предстательной железы и другими онкологическими заболеваниями.

Морфологическое изучение материала проводилось в соответствии с Международной гистологической классификацией опухолей мочевого пузыря Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ).

Уровень мРНК определяли методом ОТ-ПЦР наборами фирмы ООО «ДНК технология» Россия согласно инструкции.

Статистическую обработку результатов исследования проводили в программе StatSoft STATISTICA 12.0 с использованием методов непараметрического анализа.

Расчет безрецидивной выживаемости выполнялся точным методом Kaplan-Maier, сравнение кривых выживаемости выполнялся методом Cox и Log-Rank.

Данные были проверены на нормальное распределение. Параметрические тесты использованы в соответствующих случаях. Значения P <0,05 считались статистически достоверными

Результаты исследования.

Возраст в нашем исследование колебался от 20 лет до 91 года. При сравнении групп по возрастному составу выявлено, что в 1 группу вошли более возрастные пациенты, различия достоверны.

Таблица 1. Распределение пациентов по возрастам в группах.

Группы	Средний возраст (лет)	Кол-во больных	Ошибка	Возраст мин	Возраст макс
1	66,3	83	1,24	29,0	91,0
2	60,8*	81	1,42	22,0	91,0
3	58,4**	70	1,99	20,0	89,0
Всего	62,0	234	0,91	20,0	91,0

*- р=0,03; ** - р=0,002

Таблица 2. Распределение пациентов в зависимости от степени дифференцировки опухоли.

Группы	Степень дифференцировки			Всего
	G1	G2	G3
1	47 (56,6%)	2 (2,4%)	34 (41%)	83
2	38 (46,9%)	3 (3,7%)	40 (49,3%)	81
Всего	85	5	74	166

Мы не получили достоверных различий в распределении по фактору дифференцировки рака в 1 и 2 группах. (р>0,05).

При лечении пациентов картина в мочевом пузыре оценивалась по параметрам оценки относящихся к факторам прогноза течения заболевания (количество очагов, размер первичной опухоли). Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Группа	Количество очагов				Всего
	1	2-7		≥8
1	71 (85,5%)	11 (13,3%)		1 (1,2%)	83
2	49 (60,5%)	19 (23,5%)		13 (16%)	81
Всего	120	30		14	164
Группа	Размер первичной опухоли				Всего
	< 3см		≥ 3см
1	58 (69,9%)		25 (30,1%)		83
2	44 (54,4%)		37 (45,6%)		81
Всего	102		62		164

В 1 группе большее количество больных с единичным очагом, различия достоверные (p <0,05). При сравнении по размерам первичной опухоли определена тенденция к большему количеству пациентов с размером первичной опухоли <3 см. Первая группа - 58 человек (69,9%) и 44 во второй (54,4%), однако различия недостоверные (p >0,05).

Таблица 4.

Группы

Курение

Всего

	Есть	Нет
1	46 (55,4%)	37 (44,6%)	83
2	33 (40,7%)	48 (59,3%)	81
3	13 (18,6%)	57 (81,4%)	70
Всего	92	142	234

По нашим данным в опухолевой ткани мышечно-неинвазивного РМП и в слизистой оболочке мочевого пузыря без опухолевого роста (рак в анамнезе). Получено достоверное повышение в опухолевой ткани экспрессии ряда маркеров пролиферации. Первым исследованным нами маркером являлся Ki-67 (p <0,02).

При изучении опухолевых биомаркеров в качестве центральной характеристики брали медиану, в качестве меры разброса – квартили и применяли непараметрические методы анализа (например, критерий Краскела – Уоллиса, медианный тест). В таблице 5 представлены данные Ki-67 по медианам и квартилям.

Таблица 5. Данные измерения Ki-67 по группам

Группы	Кол-во пациентов	Мин. значение	Макс. значение	Q25	Медиана	Q75
1	83	0	608,9	0	39,4	128,0
2	81	0	222,9	0	2*	7,2
3	70	0	247,3	0	77**	22,6
Всего	234	0	608,9	0	6,5	36,8

*- p <0,03; **-p <0,01

В 1 группе значение медианы равно 39,4, во 2 группе – 2, в 3 группе -7,7, полученные различия статистически значимы (p <0,05). По уровню экспрессии Ki-67 было разделение на 2 подгруппы.

Таблица 6. Распределение по уровню экспрессии Ki-67

Группы	Ki-67		Всего
	Низкий	Высокий
1	24 (28,9%)	59 (71,1%)	83
2	44 (54,3%)	37 (45,7%)	81
3	22 (31,4%)	48 (68,6%)	70
Всего	90	144	234

*- р <0,0001

Нами определена тенденция к повышению количества образцов ткани с низким уровнем белка Ki-67 во 2 группе. 24 (28,9%) в первой, во 2 группе –54,3% и 31,4% в третьей. Данные по средним значениям среди повышенных значений показателя Ki-67 представлены в таблице 7. В группе 1 медиана 76,1 (во 2– 10,6, в 3– 14,7), различия достоверны (p <0,0001).

Таблица 7. Данные изменения высокого уровня Ki-67 по группам.

Группы	Мин значение	Макс значение	Q25	Медиана	Q75
1	59	2,6	32	76,1	157,6
2	37	1,7	3,9	10,6*	26,9
3	48	1,0	7,6	14,7*	29,9
Всего	144	1,0	7,9	25,5	80,3

*- р <0,0001

Boxplot by Group

I Min-Max группы

Рисунок 1. Изменения медианы Ki-67 по группам

Из приведенных выше данных можно сделать вывод о достоверном повышении Ki-67 в группе 1, площадь под кривой составила 0,81±0,04.

Рисунок 2

Рисунок 2. ROC-кривые при экспрессии Ki-67

Расчеты показателей чувствительности (т.е. вероятность наличия рака) и показателя специфичности (т.е. пациент находится в ремиссии или мочевой пузырь без онкологии) представлены в таблице 8.

Таблица 8. Данные чувствительности и специфичности показателя Ki-67

Группы	Ki-67		Всего
	<30	≥30
1	14 (23,7%) *	45 (76,3%) *	59
2	29 (78,4%) *	8 (21,6%)	37
3	36 (75%) *	12 (25%)	48
Всего	79	65	144

*- p <0,0001

При сравнении групп по уровню Ki-67 в зависимости от характеристик опухоли, возраста, пола и клинических проявлений заболевания проявилась тенденция к повышению уровня данного показателя при наличии гематурии, при размерах опухоли ≥ 3, при появлении отделенных метастазов (полученные различия недостоверны). Таблица 9

Таблица 9. Зависимость экспрессии Ki-67 от клинических и анамнестических факторов

Гематурия	Ki-67				р
	Кол-во пациентов	Q25	Медиана	Q75
Есть	34	39,4	106,6	157,6	Р=0,09
Нет	25	25,1	50,2	115,4
Всего	59	32,0	76,1	157,6
Размер опухоли

<3см	45	24,3	71,0	132,5	Р=0,08
≥3см	14	87,4	144,7	215,3
Всего	59	32,0	76,1	157,6
Курение в анамнезе
Есть	53	32,0	93,7	215,6
Нет	26	32,0	60,6	128,0	Р=0,17
Всего	59	32,0	76,1	157,6

Анализ безрецидивной выживаемости

На рисунке 3 представлен график безрецидивной выживаемости (БРВ) в зависимости от уровня экспрессии Ki-67. При Ki-67 <  35 о.е. - медиана БРВ составила 13 месяцев, 1летняя БРВ - 57,7 ± 8,1%, 2-х летняя - 39,8 ± 9,4% (р=0,02).

Больные раком мочевого пузыря (Kaplan-Meier) р=0,02

Ki-67 <  35

Сроки наблюдения от начала лечения, мес.                Ki-67 > 35

Рисунок 3. Безрецидивная выживаемость в зависимости от уровня экспрессии Ki67

Нами проведен многофакторный анализ сочетания BIRC5 и Ki-67 с безрецидивной выживаемостью.

Распределение пациентов с учетом уровня экспрессии белков относительно пороговых значений выглядело следующим образом: у 11-ти больных при BIRC5 ≤ 60 + Ki-67 ≤ 35, т.е. уровни экспрессии ниже пороговых значений, медиана БРВ составила 40,7 месяцев, при 1-2-3-хлетней безрецидивной выживаемости – 80,2 ± 10,3%, 5-тилетняя БРВ – 40,1 ± 28,8%.

При повышении уровня экспрессии хотя бы одного из белков выше пороговых значений медиана БРВ – 18,7 месяцев. Эти данные представлены на рисунке 33, здесь пациенты разделены на 2 группы, в 1-ую вошли больные с низким уровнем экспрессии обоих онкомаркеров, во 2-ую - все остальные пациенты: BIRC5 высокий + Ki67 низкий; BIRC5 высокий + Ki-67 высокий; BIRC5 низкий + Ki-67 высокий.

При BIRC5 >60 + Ki-67> 35, т.е. имеет место высокий уровень экспрессии белков, медиана безрецидивной выживаемости 12,7 месяцев, 1-летняя БРВ – 54,2 ± 9,5%, 3-х летняя – 19,2 ± 14,5%.

Медиана безрецидивной выживаемости в 1 группе составила 40,7 мес., во 2 – 13,7 мес. (р=0,024), 1-летняя БРВ – 55,1 ± 8,5%. Таким образом в каждом втором случае прогнозируется рецидив через 12 месяцев. Рисунок 4.

Больные раком мочевого пузыря (Kaplan-Meier)

Рисунок 4. Безрецидивная выживаемость BIRC5 + Ki67

Обсуждение.

Ki-67 – это ядерный белок, связанный с транскрипцией рибосомной РНК и является маркером клеточной пролиферации [12]. Ki-67 гиперэкспрессируется в активно растущих опухолевых клетках и указывает на плохой прогноз заболевания.

Сурвивин, также известный как BIRC5 (baculoviral inhibitor of apoptosis repeat – containing 5) – металлопротеин, относится к семейству ингибиторов апоптоза. Его функцией считается блокирование процессов апоптоза. Ингибирует Bax- и Fas-зависимые сигнальные пути. Сурвивин экспрессируется в раковых стволовых клетках [13].

Выводы.

Таким образом, нами определена прогностическая роль и значимость Ki-67 и сочетания Ki-67 + BIRC5. С учетом приемлемой для медицинских исследований информативностью (>75%) по данным нашей работы Ki-67 и BIRC5 можно считать биомаркером агрессивности мышечно-неинвазивного РМП.