Комплексный подход к решению проблемы антибиотикорезистентности сальмонелл с помощью бактериофагов и препарата на основе наносеребра

Введение. На протяжении последних десятилетий во многих странах мира регистрируют достаточно высокий уровень рисков, связанных с распространением резистентности возбудителей инфекционных болезней к антибактериальным препаратам [1–5]. Данная тенденция требует системных и безотлагательных исследований по решению проблемы на мировом уровне, что подтверждается принятием Генеральной Ассамб- леей ООН Глобального плана действий по борьбе с устойчивостью к противомикробным препаратам. В это же время в Российской Федерации также была утверждена «Стратегия предупреждения и преодоления устойчивости микроорганизмов и вредных организмов растений к лекарственным препаратам, химическим и биологическим средствам на период до 2030 г.». Проведенный анализ показал, что отечественные ме- роприятия Стратегии отличаются от других национальных программ формированием комплексного подхода к организации межведомственного и междисциплинарного взаимодействий.

К основным задачам отечественной Стратегии относятся:

• -    совершенствование мер по предупреждению и ограничению распространения и циркуляции возбудителей с антимикробной резистентностью;

• -    обеспечение системного мониторинга распространения антимикробной резистентности;

• -    изучение механизмов возникновения антимикробной резистентности и разработка про-тивомикробных препаратов и альтернативных методов для профилактики и лечения инфекционных болезней человека и животных.

Применение препаратов вирулентных (литических) бактериофагов для профилактики и лечения заболеваний, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, является одним из возможных подходов к решению проблемы антибиотикорезистентности [6–10].

В настоящее время доказано, что бактериофаги обладают рядом биологических особенностей, которые дают возможность использовать их в качестве эффективных биологических организмов для терапии заболеваний бактериальной этиологии [10–12].

По мнению ряда ученых, основным механизмом антимикробного действия бактериофагов является лизис бактериальных клеток в результате трансформации метаболизма зараженных клеток на синтез фаговых частиц, которые впоследствии разрушаются за счет активации бактериальных аутолизинов [13].

Неорганические вещества в виде наночастиц, в частности серебра, по данным ряда исследователей, также являются одним из перспективных направлений при разработке антимикробных агентов [14–16].

Современная ветеринарно-санитарная ситуация в птицеводстве, связанная со снижением эффективности применения антимикробных препаратов, выдвигает на первый план поиск новых средств и методов борьбы с инфекциями бактериальной этиологии [16–18].

Анализ литературы показал, что бактериофаги и производные нанокластерного серебра можно применять для профилактики и лечения ряда бактериальных инфекций птиц, в частности сальмонеллеза [19].

Цель исследования – научное обоснование и экспериментальное подтверждение комплексного подхода к применению антимикробных препаратов на основе бактериофагов и препарата серебра.

Материалы и методы. Работа выполнена на кафедре ветеринарной микробиологии инфекционных и инвазионных болезней Омской областной лаборатории и в птицеводческом хозяйстве Омской области. Комплексные микробиологические исследования проводили согласно общепринятым методам. На основании морфологических и культурально-биохимических характеристик, используя определитель бактерий Берджи (1997) и справочник зоопатогенных микроорганизмов (Сидоров М.А. и др. (1995)), проводили таксономическую идентификацию изолированных культур микроорганизмов. Также использовали «Методические указания 4.2.2.723-10. Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды» и руководство «Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды» (1990). Видовую идентификацию выделенных культур проводили с помощью метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-ассоциированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) с использованием масс-спектрометра VITEK NS и программного обеспечения Biotyper RTS (Германия). При этом учитывали, что значение Score ≥ 2,0 является критерием надежной видовой идентификации микроорганизмов. Для определения чувствительности выделенных микроорганизмов ( Salmonella spp .) к антимикробным препаратам применяли диско-диффузионный метод в соответствии с рекомендациями «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (версия 202101). Кроме того, клинические категории устойчивости тестируемых изолятов определены в соответствии с рекомендациями EUCAST раздела «Breakpoint tables for interpretation of MICS and zore diameters» (версия 10,0 от 01.01.2020).

Для экспериментальных исследований использовали противосальмонеллезный штамм Phagum Salmonella enteritidis DS-1, полученный нами из сточных вод и фекалий птиц и депонированный в коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером Ph-1343.

Препарат «Арговит» синтезирован на основе высокодисперсного (кластерного) серебра, стабилизированного низкомолекулярным поливи-нил-пирролидоном (ООО НПЦ «Вектор-Вита»).

Антагонистическую активность препарата «Арговит» изучали в отношении к выделенным патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Для этого изолированные культуры культивировали на скошенном мясо-пептонном агаре. Затем готовили ряд серийных разведений в стерильной воде до 106 мк/мл. Диски (d = 8 мм), пропитанные раствором препарата «Арговит», размещали на поверхность питательной среды в чашках Петри. Концентрация препарата находилась в пределах от 10 до 100 мкг/мл. В качестве контроля использовали диски, пропитанные стерильной водой.

Для статистической обработки полученных в ходе исследований экспериментальных данных использовали Т-критерий Манна–Уитни с применением прикладного программного пакета

MS Exel. Допустимый уровень статистической значимости составил 5 %.

Результаты и их обсуждение . В результате проведенного ретроспективного статистического анализа и собственных исследований установлено, что наиболее часто из проб патологического материала, фекалий, элементов технологического оборудования были изолированы микроорганизмы следующих родов и видов: Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Salmonella spp. , Proteus vulgaris , Pseudomonas aeruginosa . Также необходимо отметить, что данные микроорганизмы были выделены не только в монокультуре, но и в различных ассоциациях, в частности E. coli + Proteus vulgaris (21,4 %); E. coli + Salmonella spp . (15,9 %); E. coli + Staphylococcus aureus (26,4 %); Salmonella spp. + Staphylococcus aureus (18,6 %).

Проведенные исследования показали, что культуры Salmonella spp. , выделенные из патологического материала, в большинстве случаев проявляли множественную антибактериальную устойчивость к 80 % препаратов от числа активно применяемых в условиях птицеводческих хозяйств региона (табл. 1).

Таблица 1

Культура микроорганизмов	Антибактериальные препараты
	Т		К			Ф
	CL О О О о О d	О О СЕ s аз	о		X о	о О	О X О	Ш о	X о о X О	о о
Salmonella enteritidis	R	R	R	R	R	R	Ч	R	Ч	R
Salmonella gallinarum	R	R	Ч	R	Ч	R	Ч	Ч	Ч	R
Salmonella typhimorium	R	R	R	R	R	R	Ч	R	Ч	R

Примечание : R – резистентные; Ч – чувствительные; Т – тетрациклины; К – комплексные антибактериальные препараты; Ф – фторхинолоны.

Определение чувствительности выделенных культур Salmonella к антибактериальным препаратам

Так, все три вида Salmonella были резистентными к тестируемым антимикробным препаратам тетрациклинового ряда (доксилокс-ОР, кари-докс), в несколько меньшей степени к комплексным препаратам из группы фторхинолонов.

В рамках изучения морфологии фага DS-1 методом агаровых слоев установлено, что об- разуемые негативные колонии диаметром от 1,0 до 3,0 мм имели округлую форму, ровные кон-турированые края; центральная часть колоний фагов, как правило, прозрачная. На газоне тестируемых культур обнаруживали вокруг зон лизиса просветленные участки размером около 0,5 мм.

При изучении литической активности выделенного сальмонеллезного бактериофага (DS-1) установлено, что она составляет по методу Апельмана 10¹⁰, по методу Грациа 2,0·10¹⁰. Кроме того, анализ данных, полученных при изучении специфичности бактериофага, показал, что он обладал литическим действием в отношении культур S. enteritidis .

Тестовые исследования препарата «Арго-вит» показали, что он обладает выраженным антимикробным действием.

Установлено, что препарат «Арговит» уже при концентрации 10 мкг/мл обладал ингибирующим действием в отношении выделенных бактерий (табл. 2).

Таблица 2

Ингибирование роста микроорганизмов препаратом «Арговит»

2 2 * or СК s аз co о s s 1_____ X X о co о X се аз	Концентрация препарата «Арговит», мкг/мл	Культу		ра микроорганизмов
		Salmonella enteritidis	Pseudomonas aeroginosa	Proteus vulgaris	Escherichia coli	Staphylococcus aureus
	10	12,0±2,0	9,0±0,6	10,0±0,5	11,0±0,6	12,0±2,3
	20	14,0±1,3	13,3±1,2	14,0±0,7	12,3±0,8	13,3±2,2
	30	15,0±0,6	14,0±0,8	13,6±0,9	13,9±1,2	14,3±2,1
	40	17,0±1,8	16,6±1,1	15,3±2,0	15,0±1,6	14,0±2,0
	50	19,0±0,8	17,7±1,6	15,9±1,6	16,8±2,0	15,3±1,9
	60	20,0±2,3	19,1±1,6	17,0±2,1	16,3±1,9	15,8±1,6
	70	21,0±1,8	19,6±1,8	17,8±1,7	16,9±1,6	16,0±1,9
	80	23,0±2,1	22,7±2,2	20,3±2,0	17,7±1,2	17,1±1,6
	90	24,0±2,6	26,0±1,9	23,0±2,2	21,0±1,6	23,0±2,0
	100	24,0±2,2

Примечание : ^* – среднее значение 5 наблюдений, P ≤ 0,05.

На втором этапе исследований было сформировано три опытных группы цыплят-бройлеров по 10 гол. в каждой. Моделирование сальмонеллезной инфекции у цыплят-бройлеров проводили посредством заражения 10-суточных цыплят перорально, суспензией сальмонелл из расчета 1 · 109 КОЕ/мл на 1 голову. Культура Salmonella была предварительно выделена из патологического материала павших цыплят на предприятии. Птице первой опытной группы выпаивали суспензию сальмо-неллезного бактериофага DS-1 в дозе 0,5 мл. Цыплятам второй опытной группы сальмонел-лезный бактериофаг DS-1 применяли совместно с препаратом «Арговит» в дозе 0,5 и 1,5 мл соответственно. Третьей группе вводили антибиотик энрофлоксацин, рекомендованный при сальмонеллезах птицы согласно инструкции фирмы-производителя.

Анализ результатов экспериментальных исследований показал, что у цыплят в первой и второй группах установлено достоверное увеличение лактобактерий до 6,27 ± 0,17 и 7,35 ± 0,10 lg КОЕ/г соответственно.

Кроме того, зарегистрировано достоверное увеличение количества бифидобактерий как в первой, так и во второй опытных группах до 6,53 ± 0,09 и 7,01 ± 0,06 lg КОЕ/г соответственно. Указанную тенденцию наблюдали и в отношении лактозопозитивных энтеробактерий. Вместе с тем и в первой, и во второй опытных группах установлено достоверное снижение количества лактозоотрицательных энтеробактерий. Необходимо отметить, что после первого комплексного применения сальмонеллезного бактериофага и препарата «Арговит» экспериментально зараженным цыплятам-бройлерам только в трех из 10 проб фекалий были выделены культуры S. enteritidis .

После второго сочетанного введения указанных препаратов (на 22-е сут) сальмонеллезные культуры не выделяли.

Кроме того, установлено, что сочетанное применение сальмонеллезного бактериофага и препарата «Арговит» у цыплят-бройлеров при экспериментальной сальмонеллезной инфекции увеличивает на 60 % терапевтическую эффек- тивность по сравнению с традиционной схемой с использованием антибиотиков.

Таким образом, проведенные исследования позволяют констатировать, что сальмонеллез-ный бактериофаг и препарат «Арговит», созданный на основе кластерного серебра, обладают хорошо выраженными противомикробны-ми характеристиками в отношении бактерий рода Salmonella spp . in vitro . Кроме того, комплексное использование препаратов при лечении экспериментального сальмонеллеза у цыплят-бройлеров способствовало оптимизации энтеромикробиома, снижая уровень условнопатогенных и патогенных бактерий, в частности Salmonella spp .