Лазерная криоскопическая видеомиллиосмометрия для определения точки замерзания молока термисторным криоскопическим методом и наблюдения его кинетики
Автор: Градов Олег Валерьевич
Журнал: Молочнохозяйственный вестник @vestnik-molochnoe
Рубрика: Технические науки
Статья в выпуске: 3 (7), 2012 года.
Бесплатный доступ
Описывается создание на известной высококачественной платформе МТ-2 прибора, способного поддерживать динамические наблюдения и регистрацию динамики / кинетики физико-химических процессов при осмометрии - криоскопии молокопродуктов в автоматическом режиме. Реализация модернизации МТ-2 такого типа доступна для молочно-хозяйственных предприятий и лабораторий, обладающих штатным инженерным персоналом. Конфигурация и, следовательно, стоимость модернизации являются гибкими и зависящими от задач заказчика. Конструктивно прибор представляет собой альтернативу дорогостоящим зарубежным осмометрам, описываемым во введении.
Миллиосмометр, криоскопическая осмометрия, точка замерзания, термисторный криоскопический метод, нанолитровая осмометрия, лаборатории на чипе, депрессия температуры кристаллизации, лазерная криоскопическая видеомиллиосмометрия
Короткий адрес: https://sciup.org/14998649
IDR: 14998649
Текст научной статьи Лазерная криоскопическая видеомиллиосмометрия для определения точки замерзания молока термисторным криоскопическим методом и наблюдения его кинетики
Криоскопическая осмометрия как метод известна со второй половины XIX века, но активно применяется в биологии с начала XX века после распространения книги Кохена "Physical Chemistry for Physicians and Biologists" [1]. Современная криоскопическая осмометрия, основанная на измерении депрессии температуры кристаллизации растворов и биологических жидкостей в миллиосмометрах-криоскопах, позволяющих определять точку замерзания (в ЕС и США подобные приборы называются "freezing point depression osmometers"), представляет собой точный аддитивный метод измерения концентрации осмотически активных веществ в микрообъемах. Недостаток этих приборов состоит в том, что наблюдение процессов, происходящих в препарате в динамике, на них невозможно. Это противоречит необходимости исследования кинетики процессов в ходе замерзания биологических жидкостей и, в частности, молока.
Меж тем, в России официально действуют ГОСТы, предписывающие криоскопию как стандартный метод для определения качества молока: в РФ действуют одновременно морально устаревший ГОСТ 25101-82 «Метод определения точки замерзания», введенный постановлением Государственного комитета СССР по стандартам 25.01.1982 [2], согласно которому измерения проводятся ручным криоскопом с метастатическим термометром или прибором Бекмана относительно точки замерзания бидистиллята, а также ГОСТ 30562-97 (ИСО 5764-87) «Молоко. Определение точки замерзания. Термисторный криоскопический метод», разработанный совместно с Литовским пищевым институтом и имеющий статус межгосударственного стандарта в 10 странах бывшего СССР, согласно которому молоко охлаждается в термически контролируемой ванне криоскопа (ГОСТ предписывает 2 типа ванн - иммерсионный и циркулярный) под действием механической вибрации, после чего температура повышается до плато замерзания пробы, а температурные измерения ведутся с помощью термисторного зонда (полупроводникового терморезистора) [3]. Применение первого ГОСТа характеризуется простотой за счет наличия таблицы для пересчета точки замерзания молока на массовую долю воды в нем в составе текста ГОСТа (см. табл. 1), но второй ГОСТ является более технически совершенным и воспроизводимым методом, так как в нем есть также таблица точек замерзания стандартных солевых растворов (см. табл. 2). Принятие более совершенного ГОСТа было необходимой, вынужденной мерой, так как во всех цивилизованных странах метод Бекмана был вытеснен к 1990-м гг. криоскопией и осмометрией на автоматических приборах. В настоящее время аналогичный тренд имеет место в странах Азии.
В настольной книге многих англоязычных пищевиков «Handbook of Indices of Food Quality and Authenticity» [4] в разделе «Milk & Milk Products» (cc. 131-208) неоднократно подчеркивается важность использования осмометрии-криоскопии для контроля качества молока. В классическом сборнике-пособии «Methods for Protein Analysis» [5] рассмотрены методы осмометрии депрессии температуры замерзания в приложении к энзиматическому (ферментативному) лактозному гидролизу на молоке; аналогичные подходы рассмотрены в относительно недавней статье по принципам определения степени гидролиза пищевого белка [6]. По точке замерзания определяется содержание воды в молоке в менеджменте контроля качества в Германии [7] (этот подход очевиден, так как натуральность молока индицируется количеством растворимых компонент и выражена может быть посредством осмоляльности). Аналогичный подход применим к домашнему молоку [8].
Следует отметить, что, помимо физико-химического или биохимического контроля качества данный подход может быть использован в диагностике состояния рогатого скота, являющегося источником анализируемых проб молока. Так, посредством осмометрии на разных стадиях развития можно коррелятивно сопрячь раннюю лактацию, водный обмен и гормональный статус коров [9], процессы ферментации в рубце лактирующих коров с их статусом при учете обмена жирных кислот [10], состояние воды в растительной массе [11] в рационе жвачных с эффективностью микробной симбиотической ферментации в рубце и т. д. Более того, можно выявлять физиологические состояния и патологии скота: например, индицировать причины, ведущие к изменениям молочности коз [12], жидкостного баланса при тепловом стрессе [13], фракционирование молока коров с субклиническим маститом [14]. Аналогичные физиолого-диагностические подходы применимы для человека [15, 16].
Таблица 1. Таблица пересчета точки замерзания молока на массовую долю воды в нем.
М»«оеее мне |
|||||
...и, < |
- в JJI |
-■Ju |
-L3H |
- а. зм |
-еЛи |
0,345 |
tiJM |
lUU |
ilm |
||
2 |
ч»зя |
-tiS |
«ЙЛ* |
-»jm |
-MB |
J |
мм |
мн |
MM |
Ц3о4 |
0.495 |
4 |
-0.1*0 |
-л.мя |
«для |
-4*M |
-ДЯ |
5 |
VjU |
UjlJ |
UjOJ |
оям |
H.40S |
£ |
^411! |
-Й.ЧЙ |
-jue |
-I4.4№1 |
-MW |
7 |
—0.5I2 |
-02Ш |
-0.Ж |
-ЧЦМ |
-0.474 |
Я |
- |
— |
—ДР1 |
-и*А |
|
ч |
-03И |
-itill |
-41.402 |
-МЛ |
-UM |
10 |
-4 |
-ЦДМ |
—IM7! |
-IMM |
ЦЯ |
U |
■И.M.S |
-MW |
-MSI |
-m*c |
-UM |
я |
-4t.*Ki |
-Uv«J |
-Д4Н |
-Mie |
—MB |
а |
-4MJJ |
-ДИВ |
-UJW |
-ILMJ |
-0JU3 |
Таблица 2. Точка замерзания стандартных растворов.
ieRit-rtllfi fl кМП >iM~l ■ |
'III ■ hd Чиргн'ПS |
|
мя Mil u*f И IM UM Й.М4 Mil oPm V.l« |
-fl 4ПН -Л.4Ы MH -fi.ifl -H.W2 —U.3t2 0,5 J1 0,54 L -0.6Л0 |
0,50» -U.4L0 -41.J2D -0.5JO -ti.MO o.Mu -0.651 |
Однако, так как молоко является продуктом секреции апокриновых желез, требуется учет клеточной компоненты секрета - можно связать понижение температуры замерзания в тканях млекопитающих с осмотической активностью клеточной жидкости [17]. Имеется ГОСТ 23453-90 «Молоко. Методы определения сомати- ческих клеток», предписывающий вискозиметрическое определение включенных в состав аналита соматических клеток [18] (однако в России им предпочитают не пользоваться, ссылаясь на наличие ГОСТ Р 551232-98). Между тем, в отличие от методов проточной цитометрии, он не позволяет определить тип клеток и точное их количество, поскольку не работает с индивидуальными клетками, являясь аддитивным по принципу действия, хотя, исходя из связи осмотических свойств и наличия тех или иных клеток, следующей из вышеозначенной работы [17], необходимым являлось бы сопряжение осмометрии-криоскопии молока и наблюдения, хотя бы на грани разрешающей способности оптики, с целью компьютеризованного подсчета автономных индивидуальных клеток и их агломератов. Современные методы криоскопии, работающие на микроскопических масштабах [18] позволяют реализовывать это за счет использования микроскопа и специальных осмометри-ческих конструкций, описываемых ниже.

Рисунок 1. Clifton Nanoliter Osmometer под объективом бинокулярного микроскопа (Environmental Institute of Houston)
Квинтэссенцией этого подхода является технология нанолитровой осмометрии, при которой измерения производятся в чрезвычайно малых объёмах жидкости и могут быть проведены под микроскопом (рисунок 1). Широко распространенными, но устаревающими на данный момент приборами являются Clifton Nanoliter Osmometer и подобные ему приборы с криостатируемыми выносными камерами, что дает возможность называть их не просто нанолитровыми осмометрами, а биологическими криостатами - наноосмометрами, как это сделано на корпусе прибора, конструктивно тождественного "Clifton Nanoliter Osmometer" (рисунок 2). Конструктивно их камеры представляют собой криогенные микрореакторы или увеличенные аналоги микрофлюидных лабораторий на чипе. Недостаток этих приборов состоит в том, что без микроскопа наблюдение процессов, происходящих в препарате на них невозможно. Это противоречит кинетическому исследованию многих биохимических и криобиофизических процессов при осмометрии-криоско-пии молока в режиме реального времени (примеряемые в РФ методы имеют более статический характер [20]).
За рубежом решение данной проблемы было найдено с использованием приборов с зарядовой связью, выводящих изображение на видеомонитор, фирмой "Otago Osmometers" (рисунок 3). Данная установка позволяет визуализировать процессы, происходящие в образце и микроструктуры морфологии биологических жидкостей, однако она представляет собой завершенный прибор, не пригодный для компактного встраивания в предметные столы на микроскопах. Более того, отсутствуют реальные механизмы сопряжения осмометрических и оптических измерений на таких аппаратах при использовании конфокальной лазерной сканирующей микроскопии или лазерной допплеровской велосиметрии. Для преодоления этого требуется конструктивная переработка камеры и создание программно-аппаратного комплекса (на базе нанолитрового криостата), работа измерительных средств и механики которого синхронизируется с помощью компьютера и специализированных контроллеров при записи данных измерений в память с аналого-цифровых преобразователей.

Рисунок 2. Биологический криостат / нанолитровый осмометр. Наверху - охлаждающая камера для микроскопа.

Рисунок 3. Осмометр в видеовизуализацией - разработка фирмы «Otago Osmometers".
В России приборы такого класса не выпускались в принципе, причем как с видео, так и без видеоприставки, однако существовал и сохранился на складах во многих институтах и НИИ РАН такой высокоточный прибор, как миллиосмометр МТ-2, трансформируемый в вышеописанный тип приборов достаточно легко в силу конструктивных особенностей. Данный прибор состоит из погружной измерительной головки, устройства управления ею, позволяющего точно позиционировать ее по высоте, малообъемного термостата, модуля преобразователя, микропроцессорного контроллера и цифрового индикатора. В качестве датчика температур кристаллизации пробы используется полупроводниковый термистор. Кристаллизация индуцируется вибратором, встроенным в управляемую рабочую головку вместе с датчиком температуры. Измерение депрессии температуры кристаллизации МТ-2 производит по отношению к чистому растворителю. Высокий уровень автоматизации на стадиях обработки, пробоподачи и самодиагностики позволяет сравнивать данный прибор с зарубежными аналогами, выпускавшимися в одно с ним время (прибор производился на НПП «Буревестник» до середины 1990-х гг.), что дает возможность использовать его как базу для построения экспериментальных уста- новок высокого качества. Микропроцессор, стоящий на борту изделия, позволяет реализовывать несколько режимов работы прибора и визуализации точных данных, полученных при преобразовании напряжения в частоту, что позволяет однозначно сопоставлять картину, визуализируемую на видеомониторе (как на рисунке 3) известным значениям результатов осмометрии.
Конструкция установки и принципы работы
При доработке прибора мы опирались на работы создателя МТ-2 В.И. Кирсанова и его соавторов (в частности, [21-23]) и англоязычные протоколы [24].
Нами была произведена конструктивная доработка головки, заключавшаяся в том, что в нее дополнительно к вышеозначенному наполнению была введена и зафиксирована короткофокусная микровидеокамера, расположенная под углом к погружной конструкции так, чтобы сделать доступной визуализацию наполнения криостатируемого объема. Также в головку был введен маломощный (с целью не влиять на охлаждение) лазерный модуль, перемещавшийся по аппликате вместе с камерой. Модуль запитан от стабилизированного относительно низковольтного источника питания, подводка которого введена через щель, прорезанную в задней стенке короба, прикрывающего головку. Из аналогичной щели был выведен кабель сигнала и кабель блока питания микровидеокамеры. Сигнал камеры подан на выносную плату видеозахвата, коммутированную к компьютеру. Установленное на нем программное обеспечение, помимо утилит захвата, позволяет визуализировать сложные паттерны, регистрирующиеся камерой при взаимодействии лазерного пучка с жидкостью, кристаллизуемой в аппарате. Факультативно в состав установки может быть введен также видеомонитор для наблюдения, как это показано на рисунке 1. Позитивной стороной, с точки зрения оптики, в этом случае будет дополнительное увеличение массы установки, то есть ее оптической стабильности, что, впрочем, и так достигается массой миллиосмометра МТ-2, составляющей примерно 20 кг. Общий вид установки показан схематично на рисунке 2. Введение в ее состав аналого-цифрового преобразователя позволяет сделать ее полностью автоматизированной по отношению к съему / регистрации сигнала, однако усложняет вид схемы, поэтому он з десь не изображен. _____

Рисунок 4. Лазерный криоскопический видеомиллиосмометр на базе МТ-2. Конструкция и исполнение автора.
Данная схема позволяет реализовать динамические измерения и мониторинг явлений кристаллизации во времени. Проблемным моментом является поверхностный характер их визуализации, связанный с тем, что минимальный объем вливаемого в стандартной форме термостата прибора составляет 200 мкл, однако эта проблема решается путем разработки и изготовления под заказ в мастерских специализированных лунок-кювет под конкретные задачи пользователя. При этом, однако, прибор будет требовать внеочередной калибровки в соответствии с используемыми стандартами, так как заявленные производителем нормы (предел допустимой систематической составляющей основной приведенной погрешности не более ±0,5 % при пределе допустимого среднего квадратичного отклонения случайной составляющей основной приведенной погрешности не более 0,3 %) не будут выполняться с достаточной точностью. Либо придется использовать многократные измерения с целью последующего усреднения данных выборки, что сделать также не представляет труда, так как продолжительность измерения (на сохранившихся приборах) составляет порядка двух минут при сравнительно небольшой потребляемой мощности (до 200 Вт за счет установки элемента Пельтье в качестве охладителя).

Рисунок 5. Общая схема установки для лазерной криостатной милливидеоосмометрии.
Теоретически возможно (это имеет смысл лишь на дефектных или исчерпавших срок эксплуатации миллиосмометрах) развязать механику опускания головки с измерительной системой, заменив исходную конструкцию применением шаговых двигателей с числовым программным управлением с коммутацией на LPT-порт управляющей рабочей станции. В таком случае можно избежать полного погружения головки в лунку, допустив тем самым использование произвольных по размерам резервуаров для анализа. Впрочем, способность достижения требуемого результата зависит от их конфигурации и подгонки под размеры элемента Пельтье.
Примеры получаемых с помощью данной установки муарограмм, характеризующих процессы замерзания молока или мол окоп роду кто в приведены на илл. 6.

Рисунок 5. Примеры лазерных микроскопических муарограмм на малом увеличении.
Заключение
Таким образом, становится возможным создание на известной высококачественной платформе прибора, способного поддерживать динамические наблюдения и регистрацию динамики / кинетики физико-химических процессов при криоскопии в автоматическом режиме. Реализация подобной модернизации доступна для молочно-хозяйственных фирм и лабораторных структур, обладающих штатным инженерным персоналом. Конфигурация и, следовательно, стоимость данной модернизации являются гибкими, хотя конструктивно система представляет собой альтернативу зарубежным осмометрам, сопрягающий в силу наличия лазерно-оптической компоненты и компьютерной обработки свойства цитометра, нефелометра, гранулометра, спекл-интерферометра в аспекте эффективности измерений, сохраняя при этом базовую функцию миллиосмометра-криоскопа.
Автор выражает благодарность разработчику отечественных осмометров линеек МТ и ОСКР В.И. Кирсанову за телефонную консультацию по техническим вопросам во время работы над установкой (в 2010 году), а также зарубежным коллегам, давшим возможность работы с современной зарубежной литературой в ходе подготовки настоящей статьи.
Список литературы Лазерная криоскопическая видеомиллиосмометрия для определения точки замерзания молока термисторным криоскопическим методом и наблюдения его кинетики
- Cohen E. Physical Chemistry for Physicians and Biologists, 354 p., H. Holt & Company. -New York, 1903.
- ГОСТ 25101-82. Молоко. Метод определения точки замерзания.
- ГОСТ 30562-97 (ИСо 5764-87). Молоко. определение точки замерзания. Термисторный криоскопический метод.
- Singhal R.S., Kulkarni P.R., Rege D.V., Woodhead Publishing, 1997, 561 p.
- Wong T.M., Boyce C.O.L. Monitoring proteolysis by osmometry. In: Methods for Protein Analysis (Ed. by J.P. Cherry, R.A. Barford), pp. 42-51, The American Oil Chemists Society, 1988, 270 p.
- Nielsen P.M., Petersen D., Dambmann C. Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis. Journal of Food Sci., Vol. 66, No. 5, pp. 642-646 (2001).
- Büttel B., Fuchs M., Holz B. Freezing point osmometry of milk to determine the additional water content -an issue in general quality control and German food regulation. Chem Cent J. 2008; 2: 6.
- Ho T.F., Yip Y.C.L., Tay J.S.H., Wong H.B. Variability in Osmolality of Home Prepared Formula Milk Samples. Journ. Trop. Pediatr., Vol. 31, Issue 2, pp. 92-94 (1985).
- Maksiri W., Chanpongsang S., Chaiyabutr N. Relationship of Early Lactation and Bovine Somatotropin to Water Metabolism and Mammary Circulation of Crossbred Holstein Cattle. Asian-Australasian journal of animal sciences, Vol. 18, No. 11, pp. 1600-1608 (2005).
- Dijkstra B., Boer H., van Bruchem J., Bruning M., Tamminga S. Absorption of volatile fatty acids from the rumen of lactating dairy cows as influenced by volatile fatty acid concentration, pH and rumen liquid volume. British Journal of Nurvition, Vol. 69, pp. 385-396 (1993).
- Boyer J.S. Measuring the Water Status of Plants and Soils, 178 p., Academic Press, 1995.
- Dahlborn K., Nielsen M.O., Hossaini-Hilali J. Mechanisms causing decreased milk production in water deprived goats. Options Medit., Ser. A: Seminair. Medit., No. 34, p. 199-202 (1997).
- Ollson K., Dahlborn K. Fluid balance during heat stress in lactating goats. Quarterly Journal of Experimental Physiology, Vol. 74, pp. 645-659 (1989).
- Bruckmaier, R.M, Ontsouka, C.E., Blum, J.W. Fractionized milk composition in dairy cows with subclinical mastitis. Veterinarni Medicina -UZPI, Vol. 49, Issue 8, pp. 283-290 (2004).
- Janjindamai W., Chotsampancharoen T. Effect of Fortification on the Osmolality of Human Milk. Journ. Med. Assoc. Thai., Vol. 89, No. 9, pp. 1400-1403 (2006).
- Thatrimontrichai A., Janjindamai W. Safety of superfortification of human milk for preterm, Asian Biomedicine, Vol. 5, No. 6, pp. 825-830 (2011).
- Brodsky W.A., Appelboom J.W., Dennis W.H., Rehm W.S., Miley J.F., Diamond I. The freezing point depression of mammalian tissues in related to the question of osmotic activity of cell fluide. Journ. Gen Physiol., Vol. 40, No. 2, pp. 183-199 (1956).
- ГОСТ 23453-90. Молоко. Методы определения соматических клеток.
- Koumantakis G., Wyndham L.E. An evaluation of osmolality measurement by freezing point depression using micro-amounts of sample. Journ. Automat. Chem., Vol. 11, Issue 2, pp. 80-83 (1989).
- Илюхин, В. В. Измерение криоскопической температуры молока-сырья/В. В. Илюхин [и др.]//Молочная промышленность. -2005. -N 12. -С. 40-41.
- Кирсанов, В. И. разработка и исследование технических средств измерения концентраций осмотически активных веществ в биологических жидкостях и водных растворах: автореф. дис.... канд. тех. наук/В. И. Кирсанов. -М.: МВТУ им. Н.Э. Баумана, 1986. -С. 14.
- Кирсанов, В. И. Установка для определения концентрации осмотически активных веществ в биологических жидкостях/В. И. Кирсанов, Ю. Г. Монин, М. М. Соколова//Физиологический журнал. -1976. -Т.ХII. -№ 10. -С. 154-155.
- ГСССД 154-91. водные растворы хлоридов натрия и калия. Понижение температуры замерзания и эффективные (осмотические) концентрации. -М.: Издательство стандартов, 1991. -16 с.
- Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols (Ed. by J.G. Day, G. Stacey), 360 p., Humana Press, 2010.