Местно-раздражающие и аллергенные свойства супернатантов томатов

За последние годы в России значительно расширился ассортимент и объёмы производства безалкогольных напитков. Однако существует проблема: многие производители и фирмы-импортёры поставляют на потребительский рынок безалкогольные напитки с добавлением компонентов способствующих провокации аутоиммунных процессов со стороны организма потребителей. Поэтому качество потребляемых населением безалкогольных напитков вызывает серьёзные опасения.

Одними из распространённых аллергенов со стороны томатов являются профиллины. Профиллины растений были описаны как паналлергены в нескольких пищевых продуктах и пыльце растений. Сенсибилизация к профил-линам наблюдается примерно у 20% пациентов с аллергией на пыльцу, а IgЕ к профилину пыльцы вызывает сильную перекрестную реакцию с профилнами фруктов и овощей [1]. В то время как связывание IgЕ с профиллинами в пищевых источниках, содержащих гомологичные белки, наблюдается с такой же частотой, как и в пыльце, сенсибилизация IgЕ к профиллинам более выражена в экзотических фруктах, достигая 70% в банане или ананасе [2, 16-18]. Недавно Lyc е1 был идентифицирован как минорный аллерген в плодах томатов ( Lycopersicon esculentum ), проявляющий IgЕ-реактивность у 22–26% пациентов с аллергией на томаты [3, 4, 19-20]. У этих пациентов IgЕ-реактивность на томатный профиллин составляет до 42% от общей IgЕ-реак-тивности на экстракты плодов томатов.

Остаточная реактивность IgЕ, скорее всего, обусловлена другими аллергенами томатов, такими как Lyc е2 \ (b-фруктофуранозидаза), Lyc е3 \ (неспецифический белок переноса липидов [LTP]), полигалактуроназа, пектинэстераза, хитиназа, супероксиддисмутаза, связанный с патогенезом белок и до сих пор неизвестные аллергены [5–9]. У пациентов с аллергией на томаты и множественной сенсибилизацией к другим источникам пищи и пыльце, IgЕ направлен на Lyc е1 . Показал сильную перекрестную реактивность с профилном из пыльцы березы и более слабую, но значительную перекрестную реактивность с профилнами из сельдерея, моркови, вишни и ананаса. 3 IgЕ, направленный против профилина томатов, может быть ответственен за перекрестную реактивность между неродственными растительными источниками, но различия в эпитопах IgЕ внутри семейства профиллинов существуют. Более того, Lyc е1 продемонстрировал аллергенную активность благодаря своей способности вызывать высвобождение медиаторов воспаления из базофилов человека in vitro. Следовательно, вероятно, что Lyc е1 вносит существенный вклад в развитие

Актуальность работы заключается в отсутствии в доступной научно-технической литературе сведений о раздражающих и аутоиммунных свойствах супернатанта, полученном из разных сортов томатов.

Цель работы – исследовать местнораздражающих и аллергенных свойств супернатантов, предназначенных для использования в безалкогольных напитках, в том числе специального назначения.

Материалы и методы

Супернатанты, получены из томатов сортов Волгоградский, Оранж и Чёрный принц, выращенных в 2022 году в Хохольском районе Воронежской области.

Исследования проводились в специализированных лабораториях ФГБНУ ВНИВИПФиТ. В рамках исследования было изучено раздражающее и аллергическое действие супернатантов на 36 кроликах породы «Шиншилла». Исследование проводилось в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [11].

Супернатанты наносили на левый бок кролика, предварительно выстригая участок кожи размером 4×4 см. Экспозиция составляла 4 часа, процедуры проводились 5 раз в неделю в течение 20 дней.

Первое тестирование по шкале оценки кожных проб было проведено через 10 дней. При этом выстригали кожу на противоположном боку кролика и наносили супернатанты. Реакцию кожи анализировали через 24, 48 и 72 часа после смывания продукта. При отрицательном результате опыт продолжили и довели число аппликаций до 20, после чего провели повторное тестирование.

Для количественной оценки сенсибилизации к супернатантам использовали иммунологический метод по выявлению реакции клеток крови на аллерген in vitro – реакцию дегрануляции тучных клеток (РНДТК) и реакцию гистаминового шока.

Исследование раздражающего действия супернатантов на слизистые оболочки глаз проводили на кроликах. Каждый исследуемый образец в количестве 3 капель вносили в конъюнктивальный мешок правого глаза трём кроликам. Левые глаза кроликов служили контролем. Наблюдение за состоянием животных проводилось в течение 2 недель. Оценку раздражающего действия проводили согласно рекомендациям, учитывая изменение кровенаполнения конъюнктивы, состояние роговицы и радужной оболочки, количество выделений из глаз (таблица 1).

Таблица 1.

Оценка раздражающего действия на слизистые оболочки глаз

Table 1.

Evaluation of the irritant effect on the mucous membranes of the eyes

Интенсивность реакции Reaction intensity	Оценка в баллах Score in points	Раздражающий эффект Irritating effect
Отсутствие реакции | No reaction	0	Отсутствует | No effect
Слабая реакция | Weak reaction	2	Слабый | Weak
Выраженная гиперемия | Severe hyperemia	4	Слабо выраженный | Mild
Наличие лакримации | Presence of lacrimation	6	Умеренный | Moderate
Наличие выделений | Presence of discharge	8	Выраженный | Strong
Длительная, ярко выраженная гиперемия, лакримация, отек век Prolonged, pronounced hyperemia, lachrymation, eyelid edema	10	Сильно выраженный Strongly pronounced

Данные, полученные в ходе исследования, были подвергнуты статистической обработке с использованием программы Stаtistiса v10.0 (StatSoft. Inc. США). Были рассчитаны средняя арифметическая, а также стандартная ошибка средней. Достоверность различия между выборками оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Статистическая гипотеза считалась достоверной при Р˂0,05.

Результаты

Результаты исследования раздражающих свойств супернатантов показали, что нанесение их на кожу ежедневно в течение 15 суток не вызывало у кроликов изменений кожного покрова. Не отмечено покраснения кожи, утолщения кожной складки и выпадения подстриженной шерсти и шерсти, граничащей с выстриженными участками.

При пальпации выстриженных участков кожи не наблюдали болезненной реакции у животных. Данные гематологических показателей свидетельствуют, что нанесение супернатантов на выстриженные участки кожи кроликов в течение 15 суток не изменяло клиническую картину крови экспериментальных животных (таблица 2).

Таблица 2.

Гематологические показатели кроликов до и после многократного нанесения супернатантов в течение 15 дней Table 2.

Hematological parameters of rabbits before and after repeated application of supernatants for 15 days

Сроки наблюдения Observation period	Гемоглобин ммоль/л Hemoglobin mmol/L	Эритроциты 1012/л Erythrocytes 1012/L	Лейкоциты 109/л Leukocytes 109/L	СОЭ мм/ч COE mm/h
Супернатант Волгоградский
До опыта Prior experiment	7,1 ± 0,4	3,9 ± 0,4	6,7 ± 0,3	2,0 ± 0,3
1 час | 1 hour	7,9 ± 0,3	4,0 ± 0,1	6,9 ± 0,3	2,9 ± 0,1
1 сутки | 1 day	6,9 ± 0,6	4,1 ± 0,2	7,6 ± 0,2	2,2 ± 0,3
5 суток | 5 days	7,0 ± 0,2	3,9 ± 0,3	7,3 ± 0,1	2,0 ± 0,3
10 суток | 10 days	7,0 ± 0,4	4,0 ± 0,3	7,1 ± 0,3	2,0 ± 0,2
Супернатант Оранж
До опыта Prior experiment	7,0 ± 0,4	4,0 ± 0,4	6,9 ± 0,3	2,1 ± 0,3
1 час | 1 hour	7,5 ± 0,3	4,0 ± 0,1	6,4 ± 0,3	2,6 ± 0,1
1 сутки | 1 day	6,9 ± 0,6	4,1 ± 0,2	7,2 ± 0,4	2,2 ± 0,2
5 суток | 5 days	7,1 ± 0,4	4,0 ± 0,2	7,3 ± 0,3	2,0 ± 0,3
10 суток | 10 days	7,1 ± 0,4	4,0 ± 0,3	7,0 ± 0,3	2,0 ± 0,1
Супернатант Чёрный принц
До опыта Prior experiment	7,2 ± 0,5	3,8 ± 0,4	6,7 ± 0,3	2,2 ± 0,3
1 час | 1 hour	7,3 ± 0,3	4,0 ± 0,1	6,4 ± 0,3	2,7 ± 0,1
1 сутки | 1 day	7,0 ± 0,6	4,1 ± 0,2	7,2 ± 0,2	2,2 ± 0,3
5 суток | 5 days	7,1 ± 0,2	3,9 ± 0,3	7,3 ± 0,1	2,0 ± 0,3
10 суток | 10 days	7,1 ± 0,3	4,0 ± 0,3	7,0 ± 0,3	2,0 ± 0,2

Опыт по изучению раздражающих свойств супернатантов на слизистые оболочки глаз провели на 9 кроликах.

Раздражающее действие супернатантов на слизистые оболочки глаз определяли по «глазной пробе». В конъюнктивальный мешок левого глаза 5 кроликам закапывали 1–2 капли супернатантов, а в конъюнктивальный мешок правого – 1–2 капли воды. За животными вели наблюдение на протяжении 15 суток. Оценку раздражающего действия проводили через 1, 2, 3, 4 и 24 часа, 3–7 и 15 суток визуально по изменению кровенаполнения конъюнктивы, наличию лакримации и состоянию роговицы по 10 бальной системе согласно таблице 3.

Через 1 час после введения супернатантов у всех подопытных животных наблюдали слезотечение и выраженную гиперемию конъюнктивы с оценкой 4 балла. Через 2, 3 и 4 часа конъюнктива оставалась слабовыраженной в той же степени – 4 балла.

Спустя 24 часа у всех кроликов на слизистой глаз имело место наличие лакримации и отека век (раздражающий эффект – умеренный). На 2 сутки отмечали ярко выраженную гиперемию и лакримацию (раздражающий эффект – умеренный). На 4-е сутки признаки раздражения слизистой глаз постепенно исчезали. На 7 сутки видимых изменений на слизистой оболочке глаз не наблюдали. Таким образом, было установлено, что испытуемые супернатанты обладают умеренным раздражающим эффектом на слизистые оболочки глаз в течение первых 2 суток.

Таблица 3.

Аллергизирующая активность напитков на основе супернатантов (метод гистаминового шока, Р > 0,05)

Изучение аллергизирующего действия. При введении подопытным животным гистамина наблюдалась следующая реакция: возбуждение, частая дефекация, мочеиспускание, учащенное дыхание, судороги. Критерием оценки служило время от момента введения гистамина до момента бокового положения животных. Время наступления гистаминового шока у подопытных и контрольных животных находилось в близких пределах (Р > 0,05). Не было отмечено укорочения периода наступления гистаминового шока при введении исследуемых супернатантов (таблица 3). Напитки не потенцировали эффекта гистамина и, следовательно, не проявляли аллергизирую-щих свойств.

Table 3.

The allergic activity of drinks based on supernatants (histamine shock method) is statistically significant (P > 0.05)

Образец Sample	Время наступления гистаминового шока, мин Time of onset of histamine shock, min
	Животные | Animal
	Подопытные М ± т | Experimental M ± t	Контрольные М ± т | Control M ± t
Супернатант Волгоградский Supernatant Volgogradsky	18,9 ± 0,10	21,6 ± 0,30
Супернатант Оранж Supernatant Orange	20,2 ± 0,12	21,7 ± 0,20
Супернатант Чёрный принц Supernatant Black Prince	21,2 ± 0,12	21,7 ± 0,20

У подопытных морских свинок характер протекания гистаминового шока не отличался от такового у контрольных животных.

Опыты по изучению аллергенных свойств по тесту «непрямой реакции дегрануляции тучных клеток» (РНДТК) показали, что при подкожном введении супернатантов на первые сутки после введения процент дегранулированных клеток не превышал десяти (таблица 4).

Таблица 4.

Аллергенная активность супернатантов в реакции непрямой дегрануляции тучных клеток

Table 4.

The allergenic activity of supernatants in the indirect mast cell degranulation reaction

Образец		Время отбора крови, сутки | Blood sampling time, day
		1	5	10	15
Супернатант Волгоградский Supernatant Volgogradsky	Процент дегранулированных клеток Percentage of degranulated cells	9,6 ± 0,3	4,7 ± 0,19	4,0 ± 0,13	3,8 ± 0,14
	Реакция | Response	(–)	(–)	(–)	(–)
Супернатант Оранж Supernatant Orange	Процент дегранулированных клеток Percentage of degranulated cells	9,1 ± 0,41	3,6 ± 0,22	3,8 ± 0,10	2,9 ± 0,31
	Реакция | Response	(–)	(–)	(–)	(–)
Супернатант Чёрный принц Supernatant Black Prince	Процент дегранулированных клеток Percentage of degranulated cells	8,7 ± 0,41	3,2 ± 0,22	3,4 ± 0,10	2,8 ± 0,31
	Реакция | Response	(–)	(–)	(–)	(–)

На 5, 10 и 15 сутки после введения напитков процент дегранулированных клеток находился в пределах 4,8 ± 0,2 – 2,8 ± 0,30.

Таким образом, наибольший процент дегранулированных клеток наблюдался на первые сутки после введения, но и в эти сроки по количеству дегранулированных клеток реакция считалась отрицательной.

Заключение

Исследования показали, что супернатанты обладают умеренным раздражающим эффектом на слизистые оболочки глаз в течение первых 2 суток. А также два высокочувствительных теста для определения аллергизирующей активности «гистаминовый шок» и реакция дегрануляции тучных клеток показали, что при парентеральном введении все образцы не потенцируют влияние гистамина и не вызывают дегрануляции тучных клеток подопытных животных, выходящие за пределы установленных норм. Отсутствие выраженного раздражающего действия и аутоиммунной активности у супернатантов позволяет использовать их в качестве компонента безалкоголных напитков, в том числе специального назначения.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-26-00217,