Мезенхимные стромальные клетки костного мозга и их роль в формировании опухолевой ниши при онкогематологических заболеваниях

колонии на культуральном пластике и обладали способностью к дифференцировке в хондрогенном и остеогенном направлениях. В 1991 году Каплан предложил термин «мезенхимные стволовые клетки» для МСК, дающих начало различным клеткам мезодермального происхождения и способных к самообновлению [2]. В 2005 году Междуна- родное общество клеточной терапии (МОКТ, ISCT — The International Society for Cellular Therapy) предложило называть такие клетки мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (мМСК), так как лишь часть популяции соответствует критериям истинных стволовых клеток [3, 4]. Простота выделения и культивирования, способность к дифференцировке в различных направле-ниях,синтез различных биологически активных веществ открыли большие возможности к использованию МСК в регенеративной терапии. Однако на сегодняшний день большая часть информации об МСК была получена in vitro, а представление о функционировании и особенностях этих клеток in vivo весьма ограничено. Кроме того,сравнение результа-тов,полученных в разных экспериментах,ос-ложняется гетерогенностью популяции МСК костного мозга (МСК КМ), внутри которой можно выделить как клетки с характеристиками стволовых, так и клетки, вставшие на путь дифференцировки. В настоящем обзоре рассматриваются данные о происхождении, гетерогенности и фенотипе МСК КМ.

Распространение МСК

В 2006 году МОКТ представило критерии, определяющие МСК: 1) адгезия к культуральному пластику 2) определённый фенотип: CD105+, CD73+ и CD90+, CD45–, CD34–, CD14–, CD11b–, CD79–, CD19- и HLA-DR- 3) способность к дифференцировке in vitro в остеобласты, хондроциты и адипоциты [4]. Однако такое определение оказалось достаточно широким. Помимо КМ,МСК могут быть выделены из множества других органов и тканей, включая жировую ткань, пупочный канатик, периферическую кровь, сердце, лёгкие [5,6]. Все эти клетки соответствуют принятым критериям МСК. Для объяснения практически повсеместного нахождения МСК существует три предположения: 1) МСК развиваются в каждом органе или ткани независимо 2) МСК связаны с определёнными тканями,но способны циркулировать посредством кровеносного русла в другие органы и ткани 3) МСК — это циркулирующие клетки крови [7]. Стоит отметить, что несмотря на общую схожесть, МСК разных органов и тканей имеют различия,об-условленные влиянием локальной ниши [8]. Owen в работе 1988 года [9] предполагал, что

МСК КМ являются частью всех стромальных клеток организма, вписываясь в иерархическую модель, в основе которой находятся плюрипотентные стволовые клетки, дающие начало тканеспецифичным стволовым клеткам уже с ограниченными потенциями,в том числе МСК КМ,которые,в свою очередь,дают начало коммитированным предшественникам. Такие предшественники будут дифференцироваться в конкретные типы стромальных клеток в зависимости от действия ниши. Схема дифференцировки МСК КМ с тех пор изменилась благодаря новым данным, а повсеместное распространение МСК связывается с их периваскулярной локализацией [10–13].

Что касается циркуляции МСК, то хотя их можно выделить из периферической крови, вопросы вызывает характер этого явления — временный или постоянный [14]. Показано многократное увеличение числа МСК в крови крыс в условиях гипоксического стресса [15]. В условиях in vitro гипоксия индуцирует про-лиферацию,миграцию и проангиогенный эффект МСК КМ,что отражает возможную роль МСК в микроокружении опухоли, для которого характерна пониженная концентрация кислорода [16, 17].

Фенотип МСК

Одним из ключевых вопросов литературы о МСК является вопрос о том,как данные,по-лученные in vitro, соотносятся с условиями in vivo. Фенотип МСК КМ неоднороден и изменяется в культуре, что не позволяет с уверенностью утверждать, что в организме эти клетки экспрессируют те же маркеры и с той же интенсивностью [18,19]. Набор антигенов, предложенный МОКТ для определения МСК,не является специфическим только для именно стволовых клеток, в эту же популяцию попадают и стромальные клетки. В связи с этим ведётся активный поиск других маркеров МСК, среди которых CD271 [20], SCA-1 (МСК антиген-1), Stro-1, молекулы интегри-нов CD49a, CD51, CD146 [21–25]. Однако эти маркеры также могут присутствовать на поверхности других клеток (Stro-1, к примеру, экспрессируют эритробласты [26]), поэтому более надёжным представляется использование их в комбинации с другими положительными и отрицательными маркерами панели, предложенной МОКТ в 2006 г.

Основная часть МСК КМ не окрашивается маркерами плюрипотентных клеток. Однако с использованием маркеров плюрипотентных клеток, в том числе SSEA-4, Oct4 и Nanog, все же было выделено несколько популяций МСК, обладающих свойствами плюрипотентности (способность давать производные всех зародышевых листков, то есть эктодермы, мезодермы и энтодермы): APC, IA I, use [27–29] и другие.

IA I (от marrow-isolated adult multilineage inducible cells, индуцибельные взрослые клетки костного мозга с мульти-линейным потенциалом) были получены при культивировании на фибронектине и в условиях пониженной концентрации кислорода. Для этих клеток характерна дифференцировка в нервные клетки (производные эктодермы)и панкреатические клетки (производные энтодермы) в соответствующих условиях [27].

use (multilineage differentiating stress enduring, устойчивые к стрессу с мультили-нейным потенциалом дифференцировки) — субпопуляция клеток, среди особенностей которых можно выделить устойчивость к стрессовым воздействиям,низкую скорость пролиферации и образование М-кластеров, подобных кластерам эмбриональных стволовых клеток. use были выделены как из аспирата КМ, так и из культур фибробластов кожи человека [28].

Субпопуляция APC (multipotent adult progenitor cells, мультипотентные взрослые прогениторные клетки)— это очень небольшая популяция в составе пула МСК, состоящая из быстро делящихся клеток,способных давать начало клеткам трёх зародышевых листков, в том числе при инъекциях в раннюю бластоцисту [29].

В отличие от описанных субпопуляций, обладающих свойствами плюрипотентных клеток, PC (mesodermal progenitors cells, мезодермальные прогениторные клетки) дают начало только производным мезодермы (мезенхимным и эндотелиальным клеткам), то есть обладают свойством мультипотент-ности. Клетки этой субпопуляции по некоторым данным экспрессировали Oct-4, Nanog, SSEA-4, а также обладали альдегиддегидроге-назной активностью, характерной для гематопоэтических предшественников,но не зрелых МСК). PC способны к дифференцировке в МСК и эндотелий,причём полученные МСК не могут быть обратно дифференцированы в PC [30].

Таким образом, в популяции МСК КМ содержатся клетки с признаками плюрипотентности, однако их количество крайне малое, поэтому, в целом, МСК КМ являются мульти-потентными клетками, не способными давать производные энтодермы и эктодермы. Что касается вышеописанных субпопуляций МСК КМ с маркерами плюрипотентности, разобщённость полученных данных не даёт возможности соотнести эти субпопуляции друг с другом или чётко обозначить их взаимосвязь в линии развития МСК.

Показано существование стволовых клеток с мезенхимным фенотипом, но другого эмбрионального происхождения: например, стволовые клетки нервного гребня [31,32]. Для части клеток нервного гребня показана миогенная дифференцировка, индуцированная определёнными условиями культивирования [33]. В настоящий момент её возможность in vivo остаётся сомнительной, к тому же ей противоречит тот факт,что миогенное и остеогенное направление дифференцировки разделяются ещё в эмбриогенезе [34]. Однако показано,что гингивиальные фибробласты (одна из разновидностей МСК) способны к дифференцировке в миогенные фибриллы [35]. На сегодняшний день существуют протоколы дифференцировки МСК как КМ, так и других органов, в другие типы клеток, включая кардиомиоциты [36,37], нейроны [38], гепатоциты [39], клетки поджелудочной железы [40]. Таким образом, МСК являются очень пластичными клетками,а направление их дифференцировки определяется локальной концентрацией специфических факторов.

Гетерогенность МСК КМ в зависимости от условий культивирования

Гетерогенность МСК КМ была описана достаточно рано. В работе 1981 года авторы описывали морфологическое различие МСК в культуре и выявили два типа клеток: клетки 1 типа имели фибробластоподобную мор-фологию,активно делились и давали начало клеткам 2 типа. Клетки 2 типа были крупными, плоскими и имели эпителиоподобную форму. 1 тип обозначили как быстро обновляющиеся клетки, а 2 — как зрелые МСК [41]. Гетерогенность культивированных МСК КМ связывается с множеством факторов, среди которых техника получения, плотность высевания, время культивирования, состав сред и сывороток, а также различия между донорами [42–45]. Именно способ получения МСК КМ,а не пол или возраст считается определяющим различия культур, так как показана неоднородность материала из двух аспиратов одного донора,взятых в один момент времени [46,47]. В работе по изучению способности к остеогенной дифференцировкt МСК КМ здоровых доноров способность формировать кость in vivo терялась уже на 1–3 пассажах у разных доноров, при этом активность щелочной фосфатазы,как маркера остеогенной дифференцировки, не изменялась значительно, зато была отмечена разница в скорости пролиферации [48].

Различие по таким базовым характери-стикам,как размер,потенциал к остеогенной дифференцировке, форма клеток, способность к адгезии,наблюдается не только между клетками одной культуры МСК, но и внутри колонии, состоящей из потомков одной клетки, то есть КОЕф (или клон) [49]. Owen, описывая КОЕф,выделяет клетки с высоким потенциалом к самообновлению и мультипо-тентной дифференцировке и клетки с ограничением этих характеристик [9]. В качестве причин такой внутриклональной гетерогенности в настоящее время указываются спонтанная дифференцировка [47], высокая плотность клеток в колонии [51], длина теломер [50], возможное возникновение мутаций [52]. Для колоний МСК может быть характерна обратимая дифференцировка в центральной области колонии, где в сравнении с периферическими клетки слабее экспрессируют гены регуляции клеточного цикла и активнее — внеклеточного матрикса [53]. Если изменчивость внутри культуры МСК КМ можно объяснить наличием различных субпопуляций из более и менее коммитированных предшественников, то причины внутриклональной изменчивости требуют дальнейшего изучения, в том числе в целях практического применения МСК. Для обхода стадии культивирования МСК в некоторых исследованиях используется метод флуоресцентного сортинга, недостатком которого можно считать гораздо меньшее количество получаемого материала, достаточное только для небольших экспериментальных работ [54, 55].

Различие МСК по способности к дифференцировке

По отношению к дифференцировке клоны МСК КМ могут быть трипотентными, бипо-тентными и унипотентными. Ранее обсуждалась линейная модель дифференцировки МСК КМ, в которой трипотентные клетки постепенно теряли способность к адипоген-ной и хондрогенной дифференцировке, превращаясь в остеопрогениторные клетки [10]. В другой работе, исследовавшей дифференцировку клонов МСК КМ, выявлялись иные бипотентные предшественники, кроме остео-хондрогенных, а также унипотентные хондрогенные и адипогенные клоны. Интересно, что при этом наиболее часто встречающимися клонами были трипотентные, остео-хондрогенные и остеогенные. Фракция трипотентных МСК КМ состояла из быстро делящихся клеток, активно экспрессирующих CD146. Самым редким типом ожидаемо оказался адипогенно-хондрогенный предшественник, что позволяет сделать выводы о влиянии локальной ниши, факторы которой определяют направление дифференцировки мультипотентного предшественника [11]. Однако описаны случаи длительного (более полугода) непрерывного культивирования без утраты способности к дифференцировке в трёх направлениях [56].

Происхождение и периваскулярный характер расположения МСК

По локализации в КМ МСК можно разделить на периваскулярные (большинство) и находящиеся в районе эндоста. Такое расположение при этом соответствует распределению CD146: высокий уровень экспрессии наблюдается в МСК вблизи сосудов, а низкий уровень или отсутствие экспрессии во второй группе клеток. Обе группы при этом объединяла экспрессия CD271 и контакт с CD34+ГСК [57]. Периваскулярное расположение МСК позволяет объяснить повсеместное расположение МСК в организме. Так как помимо МСК в контакте с сосудами находятся перициты и адвентициальные клетки, исследователей заинтересовал вопрос о взаимосвязи всех трёх типов клеток. Исходя из данных литературы, всю совокупность взглядов можно свести к нескольким предположениям: 1)

МСК — это перициты [58] 2) Перициты — это предшественники МСК [59] 2) МСК — это адвентициальные клетки [60, 61] 3) Адвентициальные клетки — это предшественники перицитов, а перициты это предшественники МСК [62] 4) МСК — это не перициты и не адвентициальные клетки, а отдельный тип клеток [7]. Ввиду наличия фактов, подтверждающих каждую из приведённых гипотез, можно предположить, что внутри МСК можно выделить достаточно пластичные субпопуляции, иерархия и взаимоотношения которых требуют дальнейшего прояснения.

В пользу идентичности МСК и перицитов или адвентициальных клеток говорит наличие общих маркеров и способность дифференцироваться при индукции в трёх направлениях. Адвентициальные клетки также экспрессируют CD271, CD146, способны к мультипотентной дифференцировке [60]. При добавлении в культуральную среду ан-гиопоэтина-2 в адвентициальных клетках усиливается экспрессия генов маркеров перицитов, что позволило предположить их дифференцировку в перициты [63].

Перициты так же, как и МСК, способны к дифференцировке в трёх направлениях, имели сходный иммунофенотипический профиль CD146+/CD34-/CD-45–/CD56– [64]. Перициты и МСК демонстрируют сходный характер экспрессии генов, отличающий их от фибробластов [65]. Тем не менее, некоторые авторы, использующие мышиные модели, отвергают тождественность МСК и перицитов из-за недостаточной пластичности послед-них:перициты сохраняют свои свойства даже при индукции дифференцировки [66]. Как маркер, отличающий перициты и МСК, был предложен десмин,который в КМ синтезируют гладко-мышечные клетки, но не МСК [62]. Интересным представляется вопрос о взаимосвязи перицитов и группы МСК, расположенных в эндосте и отличающихся от периваскулярной фракции.

Другое направление исследований, касаю-щихсяМСК,связаноспоискомраннегообщего предшественника мезенхимных и эндотелиальных клеток. В качестве таковых описаны мезоангиобласт из эмбриональной аорты и мезенхимоангиобласт, полученный с помощью эмбриональных стволовых клеток. Мезоангиобласты — это стволовые клетки, ассоциированные с сосудами, участвующие в постнатальном формировании тканей мезодермы [67]. Мезенхимоангиобласт в культуре образует мезенхимные клетки с промежуточной эндотелиальной стадией, причём при определённых условиях можно получить три направления дифференцировки: МСК, перициты и гладко-мышечные клетки (Рисунок 1) [68].

Рисунок 1. Схема дифференцировки МСК.

Исследования последних лет обращаются к идее ангиогенного происхождения МСК, что подтверждается удачными опытами дифференцировки МСК в эндотелиальные клетки и обнаружением маркеров эндотелия, таких как CD31, CD34, рецептор к фактору роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор фон Виллебранда [7]. В то же время дифференцировка МСК в условиях культуры может не вызывать повышения экспрессии маркеров эндотелия, поэтому существование такого пути in vivo вызывает сомнения [56, 69].

В качестве источника части пула МСК рассматривается нейроэктодерма, так как МСК экспрессируют рецептор к фактору роста нейронов [70]. В настоящее время интенсивно изучаются стволовые клетки нервного гребня, приобретающие мезенхимный фенотип и участвующие в эмбриогенезе в формировании всех органов и тканей головы и шеи, а также участвующие в формировании миокарда [71].

Роль МСК в формировании опухолевого микроокружения

В настоящее время всё большее внимание уделяется вопросу о роли ниши костного мозга (КМ) в опухолеобразовании и развитии ранних рецидивов [72]. Если основной функцией МСК в здоровом КМ является поддержка гемопоэза,то при взаимодействии с раковыми клетками изменяется как фенотип,так и функции МСК — они начинают поддерживать рост опухоли и обеспечивают защиту от иммунной системы (Рисунок 2) [73–75].

Рисунок 2. Схематическое строение гемопоэтической ниши костного мозга.

Например, при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) показано снижение экспрессии таких генов, как Cxcl12, Angptl1, необходимых в поддержке ГСК [76]. Сокультивирова-ние бластов от больных ОМЛ с МСК здоровых доноров повысило выживаемость бластных клеток в присутствии цитарабина, причём ключевуюроль вэтомигралипрямые контакты между клетками [77]. В культурах МСК КМ, полученных от больных множественной миеломой (ММ), наблюдался фенотип стареющих клеток, характеризующийся увеличением размера клеток,активным синтезом ассоциированной со старением β-галактозидазы, снижением способности к пролиферации и остеогенной дифференцировке [75, 78, 79]. Под действием опухолевых клеток МСК могут дифференцироваться в опухоль-ассоцииро-ванные фибробласты (ОАФ). МСК и ОАФ имеют сходный фенотип и набор синтезируемых цитокинов. Отличие ОАФ в резком повышении уровня синтеза таких молекул, как VEGF и интерлейкин-10, а также в экспрессии та- ких маркеров, как гладко-мышечный актин, десмин,рецептор к фактору роста тромбоцитов (PDGF) [80,81]. ОАФ также поддерживают рост опухоли,а их появление может быть признаком ухудшения прогноза лечения.

Взаимодействие МСК КМ с опухолью может осуществлятьсячерез прямые межклеточные контакты и посредством выделения цитокинов и экзосом,содержащих различные белки и РНК [82,83]. Считается, что, как и в случае нормального гемопоэза, при взаимодействии с раковыми клетками главной особенностью МСК КМ является синтез специфических цитокинов, преобразующих микроокружение и выделяемых под контролем раковых клеток [84,85]. Так, при ММ одним из ключевых факторов, индуцирующим рост опухоли, является интерлейкин-6 (ИЛ-6), который выделяется МСК КМ под действием фактора FGF-β, который в свою очередь синтезируют клетки ММ при контакте с ИЛ-6 [86].

Другими особенностями МСК КМ, благоприятными для развития опухоли, являются их проангиогенный эффект и иммуносупрессивные свойства, позволяющие раковым клеткам избегать реакций иммунной системы. МСК КМ оказывают влияние на пролиферацию Т и В-клеток, могут ингибировать активацию дендритных клеток [87]. Хотя для очага опухоли характерны условия гипоксии, в КМ при этом можно наблюдать повышенную васкуляризацию, кроме того, КМ считается привлекательным для заселения раковыми клетками в том числе в связи с большим количеством сосудов [88]. Для МСК КМ при этом характерно повышение уровня синтеза таких проангиогенных молекул, как VEGF, фактор роста фибробластов-β (FGF-β) и трансформирующий ростовой фактор-β (TGF-β). Плотность сосудов в очаге опухоли считается одним из прогностических факторов, определяющих исход лечения [89]. При ММ VEGF индуцирует повышение экспрессии в миеломных клетках нескольких протоонкогенов [90]. Поэтому существует необходимость в разработке препаратов, нацеленных на ограничение сосудообразования в опухоли. МСК КМ могут являться одной из мишеней подобного лечения [74].

МСК опухоли отличаются от здоровых доноров не только фенотипически, но и генетически. В работе по изучению генома МСК КМ больных ММ выявлялись участки с повышенной мутабельностью, где можно предпо- ложить наличие генов,важных в прогрессии заболевания. При этом мутации МСК необязательно идентичны таковым в опухолевых клетках [91]. Другой причиной гематологических заболеваний может быть экспрессия эндогенных ретровирусов, представляющих из себя не кодирующие последовательности генома и в норме молчащие [92,93]. Активация транскрипции таких областей показана при разных видах рака,в том числе лейкемии, где наблюдалось повышение экспрессии последовательности HERV-K [94].

МСК КМ могут играть роль на разных стадиях развития опухоли [95,96]. Концепция преметастатической ниши предполагает, что ниша специфически изменяется ещё до появления опухолевых клеток за счёт сигналов, попадающих в КМ [97,98]. На ранних стадиях возникновение и рост опухоли могут быть связаны с уже имеющимся нарушением гемопоэза или поддержкой мутантного клона,ко-торый может иметь некое конкурентное преимущество, причины которого пока неясны. Существует предположение,что в некоторых случаях возникновение опухоли может быть связано с дефектами в стромальных клетках, что показано в случае миелодиспластическо-го синдрома [99,96]. Так как популяцию МСК КМ можно считать относительно стабильной по локализации, в отличие от гемопоэтических предшественников, возможно формирование колоний МСК, несущих мутации, в определённом участке КМ, где они будут поддерживать рост мутантного гемопоэтического клона [100].

Исcледования взаимодействий опухолевых клеток и их стромального окружения в КМ необходимо для разработки новых методов лечения и преодоления резистентности, причины которой зачастую неясны. Име- ющиеся на данный момент формы терапии опухолей, локализованных в КМ, могут иметь эффект на раковые клетки, но не на клетки микроокружения, которое остаётся изменённым даже после проведённого лечения, что может приводить к ранним рецидивам [79]. В литературе рассматривается такой способ лечения заболеваний в КМ,при котором МСК используются как вектор для доставки растворимых факторов в микроокружение опухоли. Это связано с миграцией МСК в области воспаления согласно градиенту специфических хемокинов, например VEGF, интерлейкин-8, PDGF и других [101,82].

Заключение. Таким образом, МСК КМ представляют собой гетерогенную популяцию клеток, в составе которой есть как небольшое число плюрипотентных клеток,так и частично коммитированные предшественники. Основным направлением дифференцировки МСК КМ является остеогенное,однако при определённых культуральных условиях МСК демонстрируют высокий уровень пластичности, дифференцируясь в другие типы клеток,что является перспективным направлением регенеративной терапии. Гетерогенность МСК КМ при культивировании требует более детального изучения их фенотипа и происхождения, в том числе и для разработки новых методов регенеративной терапии. МСК КМ играют важную роль в патогенезе различных гемопоэтических заболеваний, являясь частью опухолевого микроокружения, черты которого могут сохраняться и после проведённой терапии. Дальнейшее изучение МСК КМ как части стромы,поддерживающей развитие опухоли,необходимо для разработки методов лечения и предотвращения развития ранних рецидивов и резистентности к лечению.